Суханова Е.В.¹, к.б.н. Дзюба Е.В.¹, к.б.н. Деникина Н.Н.¹,

к.б.н. Белькова Н.Л.¹, д.б.н. Раковская И.В.²

¹Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Россия

²Федеральное государственное бюджетное учреждение «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи», Россия

Культуральные и серологические особенности микоплазм, выделенных из черного байкальского хариуса

При изучении интестинальной микрофлоры представителей сем. Thymallidae из несообщающихся водных бассейнов Восточной Сибири обнаружен генотип Mycoplasma [1]. Ранее молекулярно-генетическими методами микоплазмы детектированы в кишечниках разных видов рыб: Kyphosus sydneyanus [2]; Gillichthys mirabilis [3]; Oncorhynchus mykiss [4] и Notothenia coriiceps [5]. Филогенетический анализ показал, что «байкальский» генотип образует в группе «hominis» кластер с микоплазмами из интестинальной микрофлоры N. coriiceps и с последовательностью из Salmo gairdnerii, полученной в результате «shortgun» секвенирования мРНК. Обнаруженный генотип Mycoplasma достоверно отличается от последовательностей типовых штаммов группы «hominis» (M. moatsii и M. sualvi с гомологией 95,0 и 93,4%, соответственно) и, таким образом, может принадлежать новому космополитному виду в составе интестинальной микрофлоры рыб. Культивирование на селективных для M. hominis средах выявило высокую скорость роста и множественную антибиотикоустойчивость байкальских микоплазм [1].

Цель работы: определение культуральных и серологических особенностей микоплазм, выделенных из черного байкальского хариуса Thymallus baicalensis.

Рыб отлавливали жаберными сетями (ячея 14–24 мм) общей длиной 500 м, на глубинах 0,5–8,0 м в р. Ангара в мае 2011 г., охлажденными транспортировали в лабораторию, препарировали в асептических условиях, для культивирования использовали разные отделы кишечника, жабры, почки и печень. Органы рыб гомогенизировали со стерильным физраствором (0,9% NaCl), гомогенат центрифугировали при 4000 об/мин и проводили посев супернатанта на селективные питательные среды: жидкую с индикатором, полужидкую и твердую. Дополнительно, на твердую питательную среду высевали аликвоты из накопительных культур, полученных после инкубирования на жидких средах и положительного изменения цвета среды. Посевы инкубировали при 37°С в течение 10 сут. Для реакции агрегат-гемагглютинации проводили несколько последовательных двукратных разведений полученного супернатанта с помощью мерных петель в планшете микротитратора «Такачи» с V-образными лунками, добавляли в равном объеме эритроцитарный диагностикум, инкубировали в течение двух часов при 37°С, полученные результаты учитывали по 4-крестной системе. Для определения антител на M. hominis делали мазки из органов рыб, препараты подсушивали при комнатной температуре и фиксировали в 96% спирте 15 мин. После полного испарения спирта на препарат наносили сыворотку с антителами на M. hominis, помещали во влажную камеру, инкубировали 25–30 мин при 37°С, промывали проточной водой 10 мин и подсушивали при комнатной температуре. Результаты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа AXIO-Imager.M1 (Zeiss, Германия) при ×100 увеличении.

Эксперименты по выделению микоплазм на селективных питательных средах показали, что специфический рост колоний в виде мелких зерен отмечен только для образцов из кишечника рыб. При визуализации колоний в световом микроскопе было установлено, что они имеют вид черных зерен, характерной особенностью которых является появление прозрачности при изменении фокусного расстояния. Микоплазмы при благоприятных условиях культивирования образуют колонии в виде «яичницы-глазуньи». Однако известно, что отдельные виды микоплазм способны формировать только сосочкообразные и равномерно зернистые колонии [6], как в случае с проанализированными изолятами. Серологический анализ (реакция агрегат-гемагглютинации) показал, что в заднем и переднем отделах кишечника черного байкальского хариуса обнаружены антигены к M.hominis, титр которых варьировал от 1:2 до 1:4 Аг. Результаты РАГА в других органах (печень, почки, жабры) были отрицательными. Селективная детекция с использованием антител на M.hominis выявила микоплазм во всех проанализированных органах и тканях черного байкальского хариуса. При исследовании препаратов из кишечника свечение было максимальным, в других тканях и органах детектированы отдельные клетки микоплазм в небольшом количестве, что, вероятно, свидетельствует о неспецифических взаимодействиях антител.

Работа выполнена в центре по микоплазмозам ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» в рамках программы РАН № 30, подпрограммы 1, проект 30.13.

Литература:

1. Молекулярно-генетическая и культуральная диагностика Mycoplasma в рыбах сем. Thymallidae / Е. В. Суханова [и др.] // ДАН, 2011. – Т. 440. – № 1. – С. 139-141.

2. Moran D. Ontogenetic development of the gastrointestinal microbiota in the marine herbivorous fish Kyphosus sydneyanus / D. Moran, S. J. Turner, K. D. Clements // Microb. Ecol. –2005. – V. 49. – P. 590–597.

3. Dominance of Mycoplasma in the guts of the long-jawed mudsucker, Gillichthys mirabilis, from five California salt marshes / N. Bano [et al.] // Environ. Microbiol. – 2007. – V. 9. – P. 2636–2641.

4. Kim D.-H. Microbial diversity of intestinal contents and mucus in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) / D.-H. Kim, J. Brunt, B. Austin // J. Appl. Microbiol. – 2007. – V. 102. – P. 1654–1664.

5. Characterization of the intestinal microbiota of two Antarctic notothenioid fish species / N. L. Ward [et al.] // Extremophiles. – 2009. – V. 13. – P. 679–685.

6. Квасников Е. И. Молочнокислые бактерии пресноводных рыб / Е. И. Квасников, Н. К. Коваленко, Л. Г. Материнская // Микробиология. – 1977. – T. ΧLVI. – C. 755–760.