Биологические науки/ Микробиология

Д. б. н. Домрачева Л.И.¹, Елькина Т.С.¹, Березин Г.И.²,

Злобин С.С.², Гайфутдинова А.Р.¹

¹Вятская государственная сельскохозяйственная академия,

²Вятский государственный гуманитарный университет, г. Киров

Использование цианобактерий для биотестирования почв при их химическом загрязнении

Состояние микробиоты является одним из показателей, которые в настоящее время используются для биодиагностики почвы. Среди бактерий, постоянно присутствующих в педоценозах, особую роль играют цианобактерии (ЦБ) как первичные продуценты органического вещества, автотрофные по углероду (оксигенный фотосинтез) и азоту (азотфиксация у гетероцистных форм). Вегетация этой группы организмов присуща любому типу почвы и характерна для разных климатических зон. Наиболее явного развития ЦБ достигают при «цветении» почвы, при котором плотность популяций ЦБ в наземных разрастаниях достигает десятков миллионов клеток на 1 см². Вследствие этого ЦБ намного легче выделять в чистую культуру и идентифицировать по сравнению с сапротрофными бактериями.

Дальнейшее биотехнологическое использование альгологически чистых или аксеничных культур ЦБ связано как с получением на их основе многофункциональных биопрепаратов, обладающих антагонистической, сорбционной, детоксикационной активностью, так и с применением ЦБ в качестве организмов-биотестеров, реагирующих на уровень загрязнения окружающей среды поллютантами минерального и органического происхождения.

В частности, исследования, выполненные в последние годы в Вятской государственной сельскохозяйственной академии (Домрачева и др., 2008), показывают, что биотестирование, проведённое с помощью ЦБ, адекватно отражает уровень химического загрязнения среды. Метод биотестирования с использованием ЦБ основан на определении дегидрогеназной активности этих организмов с помощью 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ). ТТХ, акцептируя мобилизованный дегидрогеназой водород, превращается в 2,3,5-трифенилформазан (ТФФ), имеющий красную или малиновую окраску. При определении токсичности среды выбранные штаммы ЦБ сначала выдерживаются в испытуемом растворе, затем помещаются в раствор ТТХ, а затем микроскопическим методом определяют на мазках определяют в популяции соотношение жизнеспособных (с красными кристаллами внутри) и нежизнеспособных (без кристаллов) клеток.

В частности, в ходе экспериментов при испытании на токсичность в водном растворе солей свинца (Pb), никеля (Ni), мышьяка (As), метилфосфоновой кислоты (МФК) установлено, что по мере увеличения концентрации токсиканта происходит уменьшение процентного содержания жизнеспособных клеток с одновременным ростом процента мёртвых клеток. Например, при экспозиции культуры Nostoc paludosum в растворах ацетата свинца возрастающей концентрации происходит стремительное падение численности жизнеспособных клеток в популяции ЦБ с 91,47% в контроле до 4,93% при концентрации свинца 3000 мг/л (табл. 1).

Таблица 1

Влияние свинца на жизнеспособность клеток Nostoc paludosum (%)

Концентрация свинца, мг/л	Клетки живые	Клетки мёртвые
Контроль (вода)	91,47±1,5	8,53
3	88,20±3,16	11,80
30	18,45±4,59	81,55
300	17,07±6,74	82,93
1500	11,12±1,60	88,88
3000	4,93±0,34	95,07

Аналогичная картина наблюдается и при действии других токсикантов на клетки ЦБ (табл. 2, 3).

Таблица 2

Влияние мышьяка на жизнеспособность клеток Nostoc paludosum (%)

Концентрация мышьяка, мг/мл)	Клетки живые	Клетки мёртвые
Контроль (вода)	93,93±9,30	6,07
10^-2	25,48±7,31	74,52
10^-1	0	100

Таблица 3

Влияние никеля на жизнеспособность клеток Nostoc paludosum (%)

Концентрация никеля, мг/мл)	Клетки живые	Клетки мёртвые
Контроль (вода)	96,93±4,32	3,07
2	83,53±15,40	16,47
20	2,94±2,72	97,06

Наиболее интересные и практически значимые результаты биотестирования тетразольно-топографическим методом можно получить при работе с почвенными вытяжками. Не отменяя и не подменяя химический анализ почв, биотестирование даёт быстрый и чёткий ответ о состоянии почвы в исследуемом районе, особенно если исследуемый объект является потенциально экологически опасным. Наши исследования были проведены с образцами почвы, отобранными на территориях, прилегающей к химическому комбинату и в зоне действия полигона захоронения ядохимикатов. Для сравнения исследовали почвенную вытяжку серии модельных опытов, в которых в течение 3-х месяцев изучали действие пестицидов старого и нового поколений на почвенную микрофлору. В качестве тест-организма использовали ЦБ Nostoc muscorum.

Так, определение жизнеспособности клеток ЦБ в почвенной вытяжке в модельном опыте показало, что испытуемые пестициды обладают различной степенью токсичности по отношению к N. muscorum и располагаются в ряд: ДДТ>Гексохлорбензол=Круйзер>Симазин=Дивиденд стар>Гербитокс=Пивот (рис. 1). Следовательно, в группу наиболее опасных пестицидов попадают не только старые, запрещенные к применению ДДТ и гексохлорбензол, но и пестициды нового поколения – Круйзер и Дивиденд стар, в то время, как гербициды Гербитокс и Пивот оказывают на почву минимальный токсический эффект.

Рис. 1. Определение степени токсичности почвы после применения пестицидов с использованием ЦБ N. muscorum

Для оценки состояния окружающей среды в районе полигона захоронения ядохимикатов заложено 8 площадок мониторинга. При сравнении соотношения живых и мёртвых клеток в популяции ЦБ N. muscorum было установлено, что максимальной токсичностью обладает почва с участка №1 (более 80% нежизнеспособных клеток). Среди других участков наиболее токсичноны площадки мониторинга №№ 3, 4, 6, где количество погибших клеток ЦБ превышает 30% (рис. 2).

Рис. 2. Определение степени токсичности почвы в зоне полигона захоронения пестицидов с использованием ЦБ N. muscorum

При работе в зоне действия химического комбината мы отбирали для тестирования почвенные образцы с 8 участков. Тест-организмом была ЦБ N. linckia. Проведение химического анализа показало, что в данном случае загрязнителями природного комплекса являются фторид-, нитрат-ионы, катионы аммония, ионы тяжелых металлов. При биотестировании на двух участках отмечена 100%-ая гибель клеток ЦБ (рис. 3). Самыми чистыми можно отменить участки 904 и 921, где гибель клеток составляла не более 10%.

Рис. 3. Определение степени токсичности почвы в зоне действия химического комбината с использованием ЦБ N. linckia.

Таким образом, использование разных видов ЦБ позволяет получить оперативную информацию о степени загрязнения почвы различными токсикантами. Данный метод биотестирования не сложен в исполнении и определяет первоочередность химического анализа самых загрязнённых участков для выявления конкретных загрязнителей и их концентрации в почве.

Литература

Домрачева Л.И., Кондакова Л.В., Ашихмина Т.Я., Огородникова С.Ю., Олькова А.С., Фокина А.И. Применение тетразольно-топографического метода определения дегидрогеназной активности цианобактерий в загрязнённых средах // Теоретическая и прикладная экология, 2008. № 2. С. 23-28.