Модификация гепарином кардиотропных эффектов тиролиберина на модели изолированного сердца крысы после тотальной ишемии.

Биологические науки/8. Физиология человека и животных

д.б.н. А.Е. Хомутов, к.м.н. К.А. Пурсанов, асп.З.В. Перепелюк

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского,

Россия

МОДИФИКАЦИЯ ГЕПАРИНОМ КАРДИОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ

ТИРОЛИБЕРИНА НА МОДЕЛИ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА

КРЫСЫ ПОСЛЕ ТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ

Тиролиберин (тиреотропин-рилизинг-гормон, TRH) - гормон гипоталамуса, стимулирует высвобождение тиротропина из передней доли гипофиза, а также участвует в рилизинге пролактина, вазопрессина, гормона роста, АКТГ, и соматостатина. Помимо этого он снижает уровень кальция в крови и тормозит секрецию панкреотических ферментов, влияет на пищевое и питьевое поведение, повышает температуру тела, активирует симпато-адреналовую систему, активирует выделение норадреналина из нервных терминалей, повышает обмен катехоламинов, усиливает норадреналиновый эффект на кровяное давление и работу сердца, проявляет антидепрессивное действие [1,2].

Применение тиролиберина ускоряет восстановление роговичных рефлексов и неврологический статус, усиливает дыхательную активность и работу сердца, но не сказывается на выживаемости при различных видах шока и после клинической смерти [3]. У интактных животных он также может существенно повышать артериальное давление, частоту сердечных сокращений, частоту дыхания [4,5]. Показаны антигипоксические свойства тиролиберина и его аналогов [6,7]. Среди пептидов тиролиберин выделяется сочетанностью своих антигипоксических свойств со специфическим влиянием на дыхательную регуляцию и кислородный гомеостаз. При острой циркуляторной гипоксии тиролиберин стимулирует и восстанавливает нормальное дыхание, повышает чувствительность дыхательного центра даже в ультрамалых дозах [8]. При введении тиролиберина при асфиксии, вызванной остановкой аппарата искусственного дыхания или пережатием дыхательных путей, пептид оказывал протективное антигипоксическое действие, при этом наблюдалось повышение парциального давления кислорода в периферической крови, что связывают не с действием самого пептида, а с каскадными эффектами им индуцированными [9]. Введение аналога тиролиберина крысам, перенесшим антенальную гипоксию, приводит к улучшению у них уровня направленного внимания к действию сенсорных стимулов в 2-3,5 раза, нормализации исследовательского и эмоционального поведения, улучшению в 4 раза процесса обучения. Это, возможно, связано с восстановлением баланса активности серотонин-, дофамин- и норадренергической систем мозга, который был нарушен гипоксией у самок на 14-16 дни беременности [10]. Антигипоксический эффект тиролиберина является прямым эффектом, а не опосредован изменениями гипофиз-тиреоидной оси, что подтверждается аутоиммунизацией к тиролиберину. Тиролиберин рекомендуется использовать как антигипоксическое средство в современной медицине.

Эффекты тиролиберина связаны с увеличением под влиянием пептида содержания в цитозоле двух посредников: инозитол-трисфосфата и ионов кальция. Стадии трансдукции TRH-сигнала таковы: 1) связывание TRH-рецептора с a-cубединицей Gq-белкa; 2) гидролиз фосфолипазой С фосфатидилинозитола-4,5-бисфосфат на 1,2-диацилглицерол и инозитол-1,4,5-трисфосфат, которые являются важными внутриклеточными посредниками; 3) повышение содержания Са²⁺ в цитоплазме [11,12].

Взаимоотношения между пептидом и гепарином построены преимущественно на антагонизме. Гепарин - мощный антагонист инозитол-трисфосфата, отменяет его эффекты полностью, а эффекты тиролиберина по индукции выброса гормонов гипофизарными клетками блокирует лишь частично [13]. Тиролиберин и его аналоги, по-видимому, блокируют свойства гепарина, усиливают полимеризацию фибрин-мономера, резко снижают неферментативные фибринолитические свойства плазмы крови, обусловленные действием комплексных соединений гепарина с белками крови и аминами.

Эксперименты были проведены на 60 крысах массой 250-300 г. Работали по стандартной методике изолированного сердца Лангендорфа-Фаллена. Крысам под нембуталовым наркозом (35 мг/кг) вскрывали грудную полость, быстро вырезали сердце и помещали его в охлажденный раствор Кребса-Ханзеляйта. В нем быстро отпрепарировали аорту и подсоединяли к установке, обеспечивающей ретроградную перфузию через восходящую аорту буфера Кребса-Ханзеляйта. Установка представляла собой термостатируемый резервуар (оксигенатор), куда подавался перфузионный раствор. Резервуар соединялся силиконовой трубкой с металлической канюлей, на которую подвешивалось сердце, и термостатируемый камерой, куда оно помещалось. Перфузионный раствор подавался под давлением 85 мм водного столба, температура перфузата составляла 37⁰С. Для аэрации питающего раствора использовался воздух, который подавался через распыляющий фильтр. В левый желудочек сердца через предсердие вставляли латексный баллончик соединенный с манотроном “МДХ11С” и с самописцем “Н338”.

Сократительную активность сердца исследовали в изоволюмических условиях по Фаллену. При этом проводили запись кривой внутрижелудочкового давления для последующего расчета частоты сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин), развиваемого левым желудочком давления Р_макс(максимальной силы сердечного сокращения, мм. рт. ст.), максимальной скорости сокращения +dР_макс/dt (мм.рт.ст./мин) левого желудочка.

Через 15 минут после начала перфузии (стабилизационный период) производили контрольную регистрацию параметров сократимости миокарда. Эти данные принимали за исходные, после чего производили воздействие. Запись показателей проводили через 1, 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30 мин после введения веществ в опытах в условиях относительной нормы, или через 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40 мин после начала реперфузии в опытах на модели тотальной ишемии.

Ишемию вызывали полным прекращением перфузии органа. После 40-минутной нормотермической ишемии начинали реперфузию. Реакции восстановления сердечной деятельности наблюдали в течение 40 минут.

В работе использовались высокомолекулярный гепарин производства Московского эндокринного завода, тиролиберин синтезированный в институте Молекулярной генетики РАН.

Смесь гепарина с тиролиберином готовили с целью получения максимального количества комплекса гепарин-пептид в среде по специально разработанным методикам, при этом тиролиберин смешивали с гепарином в дистиллированной воде в определенных соотношениях (тиролиберин:гепарин - 1:1), затем смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и вводили в условиях относительной нормы, непосредственно перед ишемией или сразу после ишемии. Вещества вводили с перфузируемым раствором через канюлю непосредственно в аорту, при этом исходные концентрации веществ разбавлялись в 3 мл перфузируемого раствора.

В условиях относительной нормы гепарин практически не влиял на сократительную активность миокарда. Только сразу после введения 3 и 10 мг вещества наблюдалась в течение 1-2 секунд остановка сердца, затем 2-3 сильных сокращений в 2-3 раза превышающих норму, после чего нормальный режим работы сердца восстанавливался.

Как предишемическое, так и постишемическое введения гепарина не влияли на восстановление сократительной активности миокарда. Достоверно выше контрольных значений было только повышение ЧСС почти в 2 раза в первую минуту реперфузии (рис. 1). При постишемическом введении достоверным было увеличение Р_макс в первые минуты реперфузии до 140-170 мм. рт. ст. превышающего контрольные (на 100%) и исходные (на 70%) значения, но это не сказалось на сократительной работе сердца и его последующем восстановлении.

В самом начале реперфузионного периода как при пред- , так и при постишемичееском введении тиролиберин (0,03 мг) способствовал развитию фибрилляции желудочков, после чего в 30% случаев при предишемическом введении сердце не восстанавливалось. В остальных случаях в первые 10-15 мин наблюдалось увеличение Р_макс до 200-220 мм. рт. ст., что достоверно (р<0,01) превышало исходный уровень (в первые минуты реперфузии) и контрольные значения.

Рис. 1. Влияние тиролиберина и его смеси с гепарином на восстановление

частоты сердечных сокращений изолированного сердца после

тотальной ишемии.

1 – контроль (ишемия)

2 – тиролиберин, предишемическое введение

3 – тиролиберин, постишемическое введение

4 – смесь тиролиберин-гепарин, предишемическое введение

5 – смесь тиролиберин-гепарин, постишемическое введение

* – различия между контрольной и экспериментальными группами статистически значимы (р < 0.05).

Начиная с 10 мин реперфузии сила сердечных сокращений начинала снижаться и при постишемическом введении пептида к 15 мин достигала исходных значений и далее не менялась за время наблюдения, а при предишемическом введении уже на 30 минуте не превышала показателей контроля (рис. 2) Со снижением Р_макс постепенно увеличивалась ЧСС до показателей, близких к исходным (115-165 уд/мин). Сократительная работа сердца в реперфузионный период достоверно превышала значения контроля (р<0,01), что может говорить о стимуляции тиролиберином сократительной активности миокарда в реперфузионный период.

Рис. 2. Влияние тиролиберина и его смеси с гепарином на развиваемое

давление в левом желудочке (Р_макс) изолированного сердца

после тотальной ишемии.

1 – контроль (ишемия)

2 – тиролиберин, предишемическое введение

3 – тиролиберин, постишемическое введение

4 – смесь тиролиберин-гепарин, предишемическое введение

5 – смесь тиролиберин-гепарин, постишемическое введение

* – различия между контрольной и экспериментальными группами статистически значимы (р < 0.05).

Скорость сокращения миокарда под влиянием пептида постепенно восстанавливались до значений достоверно превышающих контрольные (р<0,05) и далее не снижались (рис. 3).

Рис. 3. Влияние тиролиберина и его смеси с гепарином на восстановление скорости сокращения (+dP/dt) изолированного сердца

после тотальной ишемии.

1 – контроль (ишемия)

2 – тиролиберин, предишемическое введение

3 – тиролиберин, постишемическое введение

4 – смесь тиролиберин-гепарин, предишемическое введение

5 – смесь тиролиберин-гепарин, постишемическое введение

* – различия между контрольной и экспериментальными группами статистически значимы (р < 0.05).

Гепарин достоверно (р<0,01) блокировал проявление положительного инотропного эффекта тиролиберина независимо от введения, различия с контролем были незначительны (рис.1). Блокада гепарином положительного инотропного эффекта тиролиберина возможно связана с антагонистическими взаимоотношениями между глюкозаминогликаном и пептидом и способностью гепарина ингибировать действие инозитол-3-фосфата, который является вторичным мессенжером тиролиберина [14].

Вместе с тем под влиянием смеси как при пред-, так и при постишемическом введении происходила стимуляция ритмической активности миокарда, которая в конечном итоге достигала исходных значений, превышая уровень контроля почти в 2 раза (р<0,01). Это вызывало постепенное увеличение значений сократительной работы сердца, которые к 40 минуте реперфузии были выше контрольных на 75% (р<0,01). Изменения скоростных показателей были аналогичны таковым в группах по изучению влияния одного тиролиберина (рис. 3).

Кардиостимулирующие эффекты тиролиберина и его смеси с гепарином носят длительный характер, и за все время наблюдения имели только положительную динамику. Исходя из полученных данных можно предполагать наличие в сердце рецепторов к тиролиберину и его прямом влиянии на работу данного органа.

Литература

1. Мирзоян Р. С., Ганьшина Т. С., Рагимов Х. С. и др. Значение адренергических механизмов в цереброваскулярном эффекте тиролиберина. Фармакол. и токсикол. 1985; 48 (5): 18-22.

2. Noble EP, Bommer M, Liebisch D, Herz A. H1-histaminergic activation of catecholamine release by chromaffin cells. Biochem Pharmacol. 1988; 37(2): 221-228.

3. Бастрикова Н. А., Крушинская Я. В., Дубынин В. А. и др., Влияние пептидергической коррекции геморрагического шока на поведение крыс в постгеморрагическом периоде. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1995; 120 (12): 623-625.

4. Яснецов В. В., Попов В. М., Киселева Н. М. и др. Вестибулопротекторные и антиамнестические свойства фрагментов адренокортикотропного гормона и их аналогов. Бюлл. эксперим. биологии и медицины 1995; 119 (6): 634-636.

5. Jedrusiak J, Brus R, Kostrzewa RM, Slowinski Z. Dopaminergic neuronal systems modulate the central cardiovascular effects of TRH in rats. // Pol J Pharmacol 1995;47(1):43-52.

6. Ашмарин И. П., Гурская И. Е., Гусева А. А. и др. Тиролиберин: новые физиологические эффекты и перспективы клинического применения. Вестн. РАМН 1992; 6: 40-42.

7. Кошелев В. Б., Белов И. Ю., Соколова Н. А. и др. Антигипоксические свойства некоторых эндогенных регуляторных пептидов. Антигипоксанты и актопротекторы: Итоги и перспективы. Санкт-Петербург, 1994. - С. 51.

8. Chepurnov S. A., Iniyushkin A. N. Respiratory effect of TRH: microinjection into nucleus tractus solitarii. Neuropeptides. 1994; 26 (1): 27-31.

9. Власова И. Г., Чепурнова Е. В., Ефимова Е. В., Чепурнов С. А., Ашмарин И. П. Тиролиберин - антигипоксическое действие пролонгированного характера. Физиол. человека 1994; 20 (6): 118-123.

10. Семенова Т. П., Клуша В. Е., Фаст А. Е. Возможность компенсации последствия антенальной гипоксии с помощью аналога тиролиберина. Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. Материалы Второй Всероссийской конференции. М., 1999. С. 68-69

11. Kaiser UB, Katzenellenbogen RA, Conn PM, Chin WW. Evidence that signalling pathways by which thyrotropin-releasing hormone and gonadotropin-releasing hormone act are both common and distinct. Mol. Endocrinol. 2004; 8(8): 1038-1048.

12. Bayliss DA, Viana F, Berger AJ. Effects of thyrotropin-releasing hormone on rat motoneurons are mediated by G proteins. Brain Res 2004; 668(1-2): 220-229.

13. Mollard P, Dufy B, Vacher P, Barker JL, Schlegel W. Thyrotropin-releasing hormone activates a [Ca2+]i-dependent K+ current in GH3 pituitary cells via Ins(1,4,5)P3-sensitive and Ins(1,4,5)P3-insensitive mechanisms. Biochem J. 1990; 268(2): 345-352

14. Tsao LI, Su TP. - IP3 receptor antagonist heparin uncompetitively inhibits [3H](+)-SKF-10047 binding to sigma receptors. Eur J Pharmacol 1996; 311(1):111-112.