Аспирант Бахметьева О.И., д.б.н. Путинцева О.В., д.б.н. Артюхов В.Г.

Воронежский государственный университет, Россия

Уровень экспрессии CD95 рецепторов лимфоцитами крови человека в условиях воздействия оксида углерода (II)

Изучение молекулярных механизмов пролиферации, дифференцировки и гибели клеток иммунной системы является одной из важнейших проблем современной иммунологии, клеточной физиологии и биохимии. В частности, исследование механизмов индукции и проведения сигнала в лимфоцитах для реализации программируемой клеточной смерти (ПКС) является актуальной задачей иммунологии. ПКС может быть вызвана внешними сигналами, действующими через рецепторные системы. Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, γ- и УФ-излучение, бактериальные токсины и др. [2].

Рецепторный путь запуска ПКС может начинаться с активации одного из расположенных на клеточной мембране рецепторов, воспринимающих внешний сигнал - Fas/CD95. Индукция ПКС через CD95 играет центральную роль в гомеостазе лимфоцитов [4]. Fas-антиген присутствует на поверхности 23 – 25 % лимфоцитов периферической крови здоровых людей [3].

Чрезмерное воздействие монооксида углерода на иммунокомпетентные клетки может привести к нарушению функционирования систем иммунитета, а возможно, и к гибели иммунокомпетентных клеток. Известно, что эндогенно образовавшийся монооксид углерода в организме человека может как стимулировать, так и ингибировать ПКС [5].

На сегодняшний день остается открытым вопрос взаимодействия монооксида углерода с иммунокомпетентными клетками в области изучения его влияния на ПКС. В связи с этим нами было исследовано влияние оксида углерода (II) на уровень экспрессии CD95 рецепторов мембран лимфоцитов крови человека.

Лимфоциты выделяли из периферической крови доноров методом седиментации в градиенте плотности фиколл-урографина (ρ = 1,077 г/см³). Суспензию клеток помещали в атмосферу оксида углерода (II), который получали лабораторным способом по химической реакции между концентрированными серной и муравьиной кислотами. Модификация лимфоцитов монооксидом углерода длилась 60, 75 и 90 мин. Для определения уровня экспрессии изучаемого маркера на поверхности мембран нативных и СО-модифицированных лимфоцитов применяли методы непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) и проточной цитофлуориметрии. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью прикладной программы Microsoft Exel.

По данным иммуноферментного анализа уровень экспрессии CD95 маркеров на поверхности мембран нативных иммуноцитов составил 0,350±0,073 опт.ед. Инкубирование суспензии клеток в атмосфере СО в течение 60, 75 и 90 минут сопровождалась снижением ИФА-сигнала до величин 0,235±0,040; 0,236±0,032 и 0,236±0,033 опт.ед. соответственно, т.е. количество CD95 молекул на мембранах СО-модифицированных клеток уменьшилось на 32,2 %.

Для подтверждения результатов, полученных с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа, при исследовании влияния СО на уровень экспрессии Fas-антигена на поверхности лимфоцитов крови человека, были проведены эксперименты по изучению анализируемого маркера на поверхности нативных и СО-модифицированных клеток методом проточной цитофлуориметрии.

Методом проточной цитофлуориметрии было выявлено, что средний уровень флуоресценции CD95 антигенов на поверхности мембран нативных иммуноцитов составил 35,98±3,12 усл. ед. После модификации суспензии лимфоцитарных клеток оксидом углерода (II) в течение 60, 75 и 90 мин. средний уровень флуоресценции CD95 комплексов понижался на 12,4, 19,5 и 27,4 % соответственно по отношению к контролю.

Таким образом, результаты, полученные с помощью метода проточной цитофлуориметрии, подтвердили данные ИФА по динамике изменения уровня экспрессии Fas-маркера на поверхности лимфоцитов крови человека после воздействия оксида углерода (II).

Итак, через 60 мин. инкубации лимфоцитов крови человека в атмосфере оксида углерода (II) происходит снижение уровня экспрессии Fas-рецептора мембран исследуемых клеток. По мнению Куценко С.А., монооксид углерода, взаимодействуя с функциональными группами аминокислот, блокирует их, при этом происходят структурно-функциональные изменения изучаемого белкового комплекса молекулы [1].

Таким образом, при длительной экспозиции лимфоцитов в атмосфере оксида углерода (II), по-видимому, может происходить дезрегуляция рецептор-опосредованного механизма реализации программированной гибели исследуемых клеток крови.

Литература:

1. Куценко С.А. Основы токсикологии / С.А. Куценко. – Санкт-Петербург: Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, 2002. – 395 с.

2. Механизм и роль апоптоза при патологии: актуальность исследования в комбустиологии (обзор литературы) / Т.А. Ушакова [и др.] // Комбустиология (электронная версия), 2004. – № 14.

3. Dysregulated Fas and Bl-2 expression leading to enhanced apoptosis in T-cell of multiple myeloma patients / M. Massaia [et al] // Blood. – 1995, V. 85. – P. 3679-3687.

4. Krammer P.H. CD95 deadly mission in the immune system / P.H. Krammer // Nature. – 2000, V. 407. – P.789-795.

5. Lingyun Wu. Carbon monoxide: endogenous production, physiological function, and pharmacological applications / Wu Lingyun, Wang Rui //Pharmacological reviews. – 2005, V. 57. - № 4. – Р. 585-630.