Чернова В.В.*, Володина В.П.**, Кулиш Е.И.*,
Колесов С.В.**
*Башкирский государственный университет, Россия
**Институт органической химии Уфимского научного центра
Российской академии наук
Полисахарид природного происхождения хитозан
(ХТЗ) способен к гидролизу основной цепи по гликозидным связям под действием неспецифических
ферментных препаратов [1]. Факт протекания гидролиза ХТЗ можно установить по
падению его молекулярной массы. Если для изучаемого полимера известно уравнение
Марка-Куна-Хаувинка, то наиболее быстрым и удобным методом определения
молекулярной массы полимера является
метод вискозиметрии. Однако получаемые этим методом значения молекулярных масс могут
не соответствовать истинным, так как уменьшение вязкости раствора полимера
может отражать не только протекание процесса гидролиза, но и перестройку надмолекулярной
структуры полимера в растворе [2]. В данной работе для изучения процесса
ферментативного гидролиза ХТЗ был использован абсолютный метод определения
молекулярной массы – метод сочетания седиментации и диффузии [3].
В качестве объектов исследования были выбраны
3 образца хитозана: ХТЗ-1 (фирмы Химмед), ХТЗ-2 и ХТЗ-3 (ЗАО Биопрогресс, Щелково),
полученные щелочным дезацетилированием крабового хитина, и ферментные
препараты: «Коллагеназа», «Лираза» (ГУП «Иммунопрепарат», Уфа) и «Трипсин»
(ФГУП НПО «Микроген», Омск). Раствор ХТЗ с концентрацией 2 % масс. готовили
растворением в течение 24 часов при комнатной температуре в уксусной кислоте с концентрацией
1 г/дл. Ферментный препарат, предварительно растворенный в небольшом количестве
воды, вносили в раствор полимера в количестве 5% от массы ХТЗ, выдерживали при
25⁰C в
течение 20 суток. После экспозиции с ферментом, ХТЗ
высаживался из раствора, промывался дистиллированной водой и высушивался до
постоянного веса. Определение коэффициентов седиментации и диффузии проводили
для растворов ХТЗ в интервале концентраций 0,05-0,3 г/дл в ацетатном буфере на
аналитической ультрацентрифуге. MSD рассчитывали согласно формуле
Сведберга, справедливой для молекул любой формы [3].
Собственные исследования авторов[4,5] позволили установить факт
существенного уменьшения и относительной, и характеристической вязкости ХТЗ в уксусной кислоте в присутствие ферментных препаратов «Лираза»,
«Коллагеназа» и «Трипсин». Но
учитывая, что растворителем для ХТЗ служат кислоты, нельзя исключить тот факт,
что причиной падения вязкости растворов ХТЗ может стать процесс протекания
кислотного гидролиза, а не собственно влияние неспецифического фермента.
Действительно, некоторое уменьшение вязкости ХТЗ имеет место и в отсутствии
ферментных препаратов.
Привлечение метода, сочетающего скоростную
седиментацию и диффузию для исследования растворов ХТЗ в уксусной кислоте,
позволяет установить следующее. Для переосажденных образцов ХТЗ в отсутствии
ферментных препаратов значения S0 и D совпадают с их
значениями для исходных образцов ХТЗ (табл.).
Таблица. Некоторые
физико-химические характеристики образцов хитозана, определенные в ацетатном
буфере с рН=4,5
|
Образец ХТЗ |
Используемый
ферментный препарат |
[η], дл/г |
S0*1013, с |
D *107, см2/с |
MSD*10-5 |
|
ХТЗ-1 |
– |
4,45 |
3,00 |
1,30 |
1,60 |
|
ХТЗ-11 |
– |
3,50 |
3,15 |
1,38 |
1,59 |
|
ХТЗ-12 |
«Лираза» |
1,10 |
1,84 |
4,00 |
0,25 |
|
ХТЗ-12 |
«Коллагеназа» |
0,60 |
1,79 |
5,70 |
0,21 |
|
ХТЗ-12 |
«Трипсин» |
1,80 |
1,97 |
3,50 |
0,42 |
|
ХТЗ-2 |
– |
6,10 |
7,13 |
1,02 |
3,34 |
|
ХТЗ-21 |
– |
4,90 |
7,20 |
1,10 |
3,12 |
|
ХТЗ-3 |
– |
3,45 |
2,15 |
1,49 |
0,99 |
|
ХТЗ-31 |
– |
2,82 |
2,20 |
1,56 |
0,97 |
Примечание: 1
– образец ХТЗ переосажден из раствора в уксусной кислоте;
2 – образец ХТЗ выделен
из ферментсодержащего раствора в 1% уксусной кислоте, время выдержки ХТЗ в
растворе – 20 суток, содержание фермента – 5% от массы ХТЗ.
Данный факт однозначно свидетельствует о том, что
значение молекулярной массы ХТЗ в процессе его переосаждения не изменяется, а
значит растворение ХТЗ в растворе уксусной кислоты, не сопровождается
гидролизом полимера. Напротив, выдержка ХТЗ в уксуснокислом растворе в
присутствии ферментных препаратов приводит к значительному уменьшению S0 и увеличению D, а
следовательно, значительному уменьшению молекулярной массы ХТЗ, имеющему место
в результате протекания процесса ферментативной деструкции.
Таким образом, использование метода сочетания
скоростной седиментации и диффузии позволяет утверждать, что в отсутствии
ферментных препаратов не происходит изменения молекулярной массы ХТЗ.
Следовательно, наблюдаемые изменения в значениях характеристической и относительной вязкости ХТЗ, прошедшего
стадию растворения в уксусной кислоте, обусловлены, перестройкой исходной
надмолекулярной структуры полимера. Напротив, в присутствии ферментных
препаратов происходит уменьшение молекулярных масс полимера, вследствие
протекания под действием ферментов гидролиза основной цепи ХТЗ.
Работа выполнена при
финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России» (г/к №02.740.11.0648)
1.
Хитин и хитозан: получение,
свойства и применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.
М.:Наука, 2002. 365 с.
2.
Кулиш Е.И.,
Чернова В.В., Вильданова Р.Ф., Володина В.П., Колесов С.В. // Вестник Башгосуниверситета. 2011. Т.16. №3. С.681.
3.
Рафиков С.Р.,
Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико-химию растворов полимеров. М.:
Химия, 1978. 320 с.
4.
Чернова В.В., Кулиш Е.И., Володина В.П.,
Колесов С.В. //
Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы Девятой
Международной конференции. Росхит, 2008 г. М.: ВНИРО. С. 234.
5.
Кулиш Е.И.,
Чернова В.В., Володина В.П., Торлопов М.А., Колесов С.В. // Современные
перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы Десятой Международной
конференции Росхит 2010. М.: ВНИРО. С.274