И.И. Черкашина, С.Ю. Никулина, Н.И. Логвиненко, В.Н. Максимов,

М.И. Воевода, В.А. Шестовицкий, В.А. Чупахина, А.В. Разводовская

Особенности полиморфизма гена хемокинового рецептора ССR5 у больных бронхиальной астмой и их родственников

Бронхиальная астма (БА) - по-прежнему остается одной из актуальных проблем пульмонологии в настоящее время. Постоянный прирост заболеваемости БА во всем мире делает актуальными исследования по изучению факторов, способствующих формированию этого заболевания. Молекулярно-генетические исследования четко показали вовлечение генетических факторов в патогенез БА. Исходя из современных представлений о патофизиологических механизмах БА, можно выделить группы генов, нарушения структуры и функционирования которых могут вносить вклад в развитие БА. К генам-кандидатам относят гены врожденного иммунного ответа и иммунорегуляции; гены, связанные с дифференцировкой и функционированием Th2; гены иммунитета слизистых оболочек; гены легочной функции и др. Однако, многие гены, имеющие отношение к патогенезу БА, недостаточно исследованы.

Среди большого числа генов, которые могут принимать участие в формировании предрасположенности к развитию БА, внимание привлекает ген хемокинового рецептора CCR5. Этот ген ответственен за направленную миграцию и выход из сосудистого русла в ткани иммунокомпетентных клеток. Ген CCR5 занимает около 6 тыс. п.н. на хромосоме 3р21. Делеция 32 п.н. в кодирующей области гена CCR5 (del32CCR5) приводит к трансляции укороченного варианта белка, не адгезирующегося на поверхности клеток. Частота делеционного аллеля гена CCR5 составляет 15,5% - 16% в различных популяциях и зависит от этнического состава населения. Сведения об ассоциации CCR5del32 с риском заболевания БА немногочисленны и демонстрируют противоречивые результаты. По данным S.M. Schuh (2002) и М.В. Флеминг (2005) наличие дефектного аллеля ССR5del32 снижает риск возникновения БА. В то же время, И.А. Эткина и соавт. (1999) определили снижение частоты встречаемости носителей нормального аллеля гена CCR5 и повышение частоты гетерозигот среди больных БА в сравнении с контролем. Наряду с этими данными, A.J. Sandford et al. (2001) не выявили статистической разницы в частоте CCR5del32 у здоровых и лиц с БА.

В целом, полиморфизм гена хемокинового рецептора CCR5 у больных БА и их родственников изучен недостаточно, его роль в патогенезе заболевания еще окончательно не определена. Поэтому, целью нашего исследования явилось изучение полиморфизма гена del32 хемокинового рецептора ССR5 у больных БА и их родственников.

Исследование проведено на материале 62 русских семей больных БА (всего 232 чел.) жителей г. Красноярска. В каждой семье выделялся пробанд с верифицированной БА. В основную группу вошли 62 больных с БА и 170 их родственника I, II, III степени родства, в т.ч. 81 мужчина (34,9%) и 151 женщина (65,1%). Среди всех родственников были выделены лица с БА, с другими аллергическими заболеваниями (аллергический ринит, атопический дерматит и др.) и здоровые. Медиана возраста пробандов составила 51,0 год [43,0; 60,0], родственников с БА - 43,0 года [22,0; 62,5], родственников с аллергическими заболеваниями - 28,0 лет [19,0; 36,8] и здоровых родственников - 28,0 лет [19,0; 40,0]. В дальнейшем, родственники с БА (28 чел.) были отнесены в группу пробандов.

Диагноз БА, степень тяжести и обострения заболевания устанавливались в соответствии с Глобальной стратегией лечения и профилактики БА (GINA 2006, 2007). Диагноз атопического дерматита (АтД), крапивницы и аллергического ринита (АР) устанавливался на основании критериев, изложенных в национальных согласительных документах (Хаитов Р.М., 2000; ARIA, 2001). Среди наблюдавшихся больных диагностированы следующие формы БА (в соответствии с МКБ - 10): аллергическая - у 73 чел (81,1%) и неаллергическая - у 17 (18,9%). По степени тяжести БА у 28 больных (31,1%) была легкой интермиттирующей, у 12 (13,3%) легкой персистирующей, у 34 (37,8%) среднетяжелой и у 16 пациентов (17,8%) тяжелой. Среди обследованных с легким обострением БА было 12 (13,3%), среднетяжелым - 49 (54,4%), тяжелым - 9 (10,0%) и не было обострения у 20 (22,2%) человек. Средний стаж болезни составил 12,3±6,1 лет.

Всем пробандам и их родственникам было проведено клинико-инструментальное исследование по следующей программе: клинический осмотр, оценка функции внешнего дыхания (ФВД) и молекулярно-генетические исследования. С помощью молекулярно-генетических методов исследованы полиморфные варианты гена хемокинового рецептора CCR5 (CCR5delta32). ДНК выделяли по стандартной методике из лейкоцитов периферической крови. Изучение полиморфных вариантов исследуемого гена проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе. Молекулярно-генетические исследования проведены на базе У РАМН НИИ терапии СО РАМН (г. Новосибирск). При оценке полиморфизма гена у больных БА и их родственников в качестве контроля использовали популяционную выборку здоровых лиц, жителей г. Новосибирска, n = 263, медиана возраста - 35,0 лет [29,0; 45,0]. Различия в распределении частот аллелей и генотипов гена ССR5 между группами оценивали посредством критерия χ². В случае четырёхпольных таблиц сопряженности сравнение выборок по частотам генотипов и аллелей применяли точный двусторонний критерий Фишера. Относительный риск (OR – odds ratio) заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли как отношение шансов (ОШ). Подсчитывали ОШ для оценки ассоциации между определенными генотипами и риском развития заболевания по стандартной формуле OR=a/b × d/c, где a и b – количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и d и с – количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип. ОШ указан с 95%-ным доверительным интервалом (Confidence interval CI). Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ «Excel», «Statistica for Windows 6.0» и «SPSS 13».

При анализе результатов исследования инсерционно-делеционного полиморфизма гена CCR5 у целой выборки больных БА мы не выявили значимых отличий в распределении генотипов и аллелей гена хемокинового рецептора CCR5 от популяционного контроля. Среди больных БА нами установлено повышение частоты носителей гомозиготного генотипа по распространенному аллелю (II) (86,7%±3,7 и 78,3%±2,6; р=0,209), явное снижение частоты встречаемости носителей гетерозиготного генотипа (ID) (13,3%±3,5 и 21,3%±2,5; p=0,092) и отсутствие носителей редкого гомозиготного генотипа (DD) в сравнении с группой контроля. Среди больных БА носители аллеля D гена CCR5 встречались в 1,6 раз реже, чем в группе контроля: 6,7%±1,9 (12 человек) и 11,0%±1,4 (58 человек). В то же время, показаны существенные отличия в распределении частот генотипов и аллелей по гену CCR5 у больных аллергической и неаллергической БА в сравнении с контролем.

Среди больных аллергической БА достоверно преобладал II генотип гена CCR5 по сравнению с лицами контрольной группы (90,4%±3,5 и 78,3%±2,6; ОШ = 0,383, 95% ДИ 0,167 – 0,881; р=0,019) и больными неаллергической БА (90,4%±3,5 и 70,6%±1,1; ОШ = 0,255; 95% ДИ 0,069 - 0,936; р=0,030). Тогда как, у больных неаллергической БА повышена доля ID генотипа по сравнению с лицами контрольной группы (29,4%±1,0 и 21,3%±2,5; р=0,715) и больными аллергической БА (29,4%±1,0 и 9,6%±3,3; ОШ = 0,255; 95% ДИ 0,069 - 0,936; р=0,030) (табл. 2). У больных аллергической БА частота аллеля D была существенно ниже (4,8%±1,8 и 11,0%±1,4; ОШ = 0,406; 95% ДИ 0,181 - 0,91; р=0,026), а у больных неаллергической БА - несколько выше, чем в популяционном контроле (14,7±6,0 и 11,0%±1,4; ОШ = 1,391; 95% ДИ 0,518 - 3,735; р=0,572). Но, достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей по гену CCR5 в группе больных неаллергической БА с популяционным контролем получено не было.

Анализ распределения генотипов полиморфизма гена CCR5 в выборке больных БА показал статистически значимую ассоциацию генотипа II с легким течением БА. Носителей генотипа II среди больных легкой БА было достоверно больше в сравнении с лицами контрольной группы (92,5%±4,3 и 78,3±2,6; р=0,034). Аллель I среди лиц с легкой астмой встречался также значимо чаще, чем в контроле (96,3%±2,1 и 89,0±1,4; ОШ = 0,314; 95% ДИ 0,096 – 1,028; р=0,045). При этом, в группе больных БА, по мере нарастания степени тяжести заболевания прослеживалась тенденция к накоплению гетерозиготного генотипа ID и аллеля D. По результатам нашего исследования, статистически значимых различий в частотах генотипов и аллелей гена хемокинового рецептора ССR5 между контрольной группой, выборкой родственников пробандов I, II и III степени родства не получено. Носители гетерозиготного генотипа (ID) и гомозиготного генотипа по редкому аллелю (DD) встречалась несколько чаще среди родственников с признаками атопии (25,5%±5,8), чем в группе контроля (21,7%±2,6), но статистически достоверных различий между исследуемыми группами не получено (OШ = 1,234; 95% ДИ 0,629 - 2,421; p=0,593). Носителей аллеля D в группе родственников с аллергией было также больше, чем в контроле (13,6±3,3 и 11,0±1,4; ОШ = 0,785; 95% ДИ 0,427 - 1,443; p=0,415). Среди здоровых родственников носители генотипов ID и DD встречались реже (14,9%±3,8), чем в контрольной группе (21,7%±2,6), но статистически достоверных различий между исследуемыми группами также не получено (OШ = 1,575; 95% ДИ 0,815 - 3,042; p=0,216). В группе здоровых родственников и контрольной группе частота гомозиготного генотипа II достигала 85,1%±3,8 и 78,3%±2,6, соответственно. Отмечено, что носителей аллеля D в группе здоровых родственников было значительно меньше в сравнении с контролем (8,0%±2,1 и 11,0±1,4; ОШ = 0,706; 95% ДИ 0,383 -1,30; p=0,314)..

Таким образом, при изучении вклада полиморфизма гена хемокинового рецептора CCR5 мы установили ассоциацию с развитием аллергической БА в семьях. Результаты нашего исследования позволяют сделать вывод о том, что аллель D гена хемокинового рецептора ССR5 можно рассматривать протективным фактором в отношении развития БА.