Использование тест-системы «Тубинферон» для диагностики латентного туберкулеза у детей

Л.И. Мордовская¹, А.М. Владимирский², В.А. Аксенова², Т.Н. Власик³

1-ГБУ РС(Я) Научно-практический центр «Фтизиатрия», г. Якутск;

2-НИИ фтизиопульмонологии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, г. Москва;

3- Российский кардиологический научный центр, Москва;

Актуальность. Интерферон-гамма (ИФН-γ) - один из ключевых факторов протективного иммунитета при туберкулезной инфекции. Существуют ряд новых иммунологических тестов для определения туберкулезной инфекции, в том числе у детей, основанных на анализе индукции ИФН-γ в образцах цельной крови, инкубированных в присутствии антигенов микобактерий туберкулеза (МБТ). В качестве специфических антигенов МБТ – индукторов ИФН-γ в последние годы используют рекомбинантные антигены ESAT-6 (ранний секретируемый антиген с молекулярной массой 6 кд) и CFP-10 (белок фильтрата культуры МБТ). Эти тест-системы используют главным образом для определения латентной туберкулезной инфекции. Поскольку антигены отсутствуют у микобактерий вакцинного штамма M.bovis(BCG) и большинства нетуберкулезных видов микобактерий такие тест-системы могут использоваться, в том числе и для обследования лиц, вакцинированных BCG.

Мы разработали отечественную тест-систему «Тубинферон» для определения туберкулезного инфицирования у детей и подростков на основе индукции в образцах цельной крови in vitro. В отличие от тест-системы QuantiFERON-TB-Gold для индукции ИФН-γ мы используем как традиционный туберкулин PPD, так и комплекс специфических антигенов ESAT-6 и CFP-10.

Цель. Изучение уровня индукции ИФН-γ клетками цельной крови in vitro в присутствии специфического антигена туберкулезного возбудителя у детей и подростков при первичной туберкулезной инфекции в сравнении с поствакцинной БЦЖ-аллергией.

Пациенты и методы. Было проведено обследование следующих групп пациентов: 268 детей и подростков с установленными диагнозами: «вираж» туберкулиновой пробы - 82 пациента; поствакцинальная аллергия - 66 пациентов; инфицированные микобактериями туберкулеза не более 2 лет – 56 пациентов; дети и подростки с первичным туберкулезным комплексом (ПТК) – 4, с туберкулезом внутригрудных лимфатических узлов (ТВГЛУ) - 45, с экссудативным плевритом туберкулезной этиологии – 15 человек; обследовали также 31 ребенка с отрицательной или сомнительной пробой Манту (31 пациент) и 122 детей и подростков с впервые выявленным туберкулезом легких.

Для исследования были (с согласия родителей) взяты образцы по 3,5 мл венозной крови с гепарином (10 ед/мл). Образцы крови были разлиты по 1 мл в три различные маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и две опытные пробы, в которые вносили по 10 мкл туберкулина PPD в концентрации по белку 1мг/мл и смесь (равные объемы) рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10 в концентрациях по белку 1мг/мл. Конечная концентрация всех антигенов по белку составляла 10 мкг в мл крови. Образцы крови в стерильных пробирках объемом 5 мл с герметично закрывающимися крышками инкубировали при 37ºС в течение 20-24 часов. На следующий день отбирали по 200 мкл образцов плазмы, в которых определяли концентрацию ИФН-γ с помощью разработанной иммуноферментной тест-системы. Результаты анализа обрабатывали, используя специальную компьютерную программу Zemfira фирмы «БиоРад» для обсчета количественного ИФА. В некоторых опытах образцы плазмы замораживали и хранили при – 20⁰С в течение 2-х недель.

Для статистической обработки полученных результатов использовали программы Microsoft Excel и SAS с использованием параметрических и непараметрических методов анализа. Определяли среднее значение, стандартное отклонение, медиану и межквартильный (25% - 75%) диапазон результатов. Достоверность различий в изучаемых группах анализировали по критерию Вилкоксона.

Результаты. В присутствии специфического для МБТ антигена ESAT-6 уровни индукции ИФН-γ у детей с отрицательной реакцией Манту с 2 ТЕ, а также детей с поствакцинальной аллергией были нулевыми или в нескольких случаях очень низкими. Концентрации ИФН-γ в этих образцах у детей с «виражом» туберкулиновых реакций составили 351 (152-537) пг/мл, тогда как у детей с поствакцинальной аллергией – 0 (0-0) пг/мл, (р<0,001) (табл.).

При использовании порогового критерия уровня индукции ИФН-γ более 70 пг/мл лишь в 2 случаях у детей с туберкулиновой пробой до 5 мм индукция ИФН-γ превышала этот уровень, а из 66 детей с клинически установленной поствакцинальной аллергией все результаты индукции ИФН-γ были ниже 70 пг/мл. При «вираже» туберкулиновой пробы из 82 обследованных детей лишь в 3 случаях уровень индукции ИФН-γ был ниже порогового критерия.

Таким образом, при использовании порогового уровня концентрации ИФН-γ 70 пг/мл в образцах надосадочной плазмы чувствительность анализа составила 96,3%, а специфичность 98,0%.

Таблица

Результаты обследования детей и подростков при дифференцировании поствакцинальной БЦЖ-аллергии от туберкулезного инфицирования при индукции ИФН-γ с антигенами микобактерий туберкулеза

Груп-пы	Диагноз	Число пациен-тов	Концентрация ИФН-γ, пг/мл - медиана, 25%-75% квартильные величины
			PPD	р	ЕSAT-6	р
1	Туберкулин- отрицательные здоровые	31	85 (48 -181)	р1-2<0,001	0 (0- 0)	р1-2 – н.д.
2	Поствакциналь-ная БЦЖ-аллергия	66	282 (208 – 440)	р2-3<0,001	0 (0 –0)	р2-3<0,001
3	«Вираж» туберкулиновыхпробы	82	552 (338– 862)	р3--6<0,001	351 (152 –537)	р3—4,5,6,7-н.д.
4	Инфицирован-ные МБТ	56	552 (294-720)	р3-4 – н.д.	336 (182-552)	р3-4 – н.д.
5	Туберкулез внутригрудных лимфоузлов	45	624 (323- 1033)	р3-5 – н.д.	377 (156 – 791)	р3-5 – н.д.
6	Плеврит тубэтиологии	15	327 (102 –691)	р3-6 – н.д.	388 (133 – 775)	р3-6 – н.д
7	Первичный туберкулезный комплекс	4	969 (640-1462)	р3-7 <0,05	704 (140-1610)	р3-7 – н.д
8	Туберкулез легких	122	213 (91 – 374)	p8-3,4,5,6<0,05	47 (19 – 161)	p8-3,4,5,6<0,01

Н.д. – недостоверно; р - критерий Вилкоксона.

Установлено, что у детей и подростков с активными формами туберкулеза легких (вторичная туберкулезная инфекция) уровень индукции ИФН-γ и ESAT-6 был значительно ниже (p<0,001), составляя 213 (91–374) с туберкулином PPD и с антигеном ESAT-6 – 47 (19-161) пг/мл, чем при различных формах первичной туберкулезной инфекции в среднем, в присутствии антигена PPD – 554 (324-896) пг/мл, для специфического антигена ESAT-6 – 356 (154-603) пг/мл. У значительной части пациентов с вторичной туберкулезной инфекцией и наличием деструкции легочной ткани и бактериовыделением уровень индукции ИФН-γ в присутствии антигенов МБТ был угнетен настолько сильно, что в ряде случаев оказывался нулевым. В дальнейшем было установлено, что в процессе лечения, при благоприятном течении процесса, специфическая индукция ИФН-γ восстанавливается. Эти данные послужили предметом отдельного исследования [2].

Заключение. Данная тест - система «Тубинферон» позволяет установить первичную туберкулезную инфекцию с чувствительностью 96,3% при специфичности 98,0%. Эти характеристики обеспечивают возможность дифференцирования первичной туберкулезной инфекции от поствакцинальной аллергии, которая может подтверждаться индукцией ИФН-γ к туберкулину при индукции ИФН-γ к специфическим антигенам ниже порогового уровня. При туберкулезе легких уровень иммунного ответа, определяемый по специфической индукции ИФН-γ, в среднем, существенно снижается, в том числе, до нулевых значений, в зависимости от выраженности туберкулезного поражения.