Коровашкина А.С., Ерошевская Л.А., Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ, НЕСУЩЕЙ ГЕН УСТОЙЧИВОСТИ К ТРИКЛОЗАНУ

Введение. В настоящее время широкое развитие получило создание ДНК-вакцин и других лекарственных средств на основе ДНК [1‒3]. Плазмиды, используемые для этих целей, должны характеризоваться небольшим размером, высокой копийностью в клетках-продуцентах, а также отсутствием генов устойчивости к антибиотикам. Последний критерий имеет большое значение, так как плазмиды могут поглощаться микрофлорой пациента, приводя к появлению штаммов микроорганизмов, устойчивых к действию антибиотиков.

Цель данной работы – создание плазмиды, способной служить элементом «безантибиотиковой системы селекции». В качестве исходной была выбрана высококопийная плазмида pXcmkn12 (Cloning Vector Collection, Япония), несущая ген бета-лактамазы. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) ген, кодирующий бета-лактамазу, был заменен на ген fabI, кодирующий один из ферментов Escherichia coli, участвующих в биосинтезе жирных кислот. По данным литературы, в результате повышенной экспрессии гена fabI, клетки, несущие такой ген, способны расти на питательной среде, содержащей антисептик триклозан.

Материалы и методы исследования. Источником гена fabI, кодирующего НАДН-зависимую редуктазу (КФ 1.3.1.9), участвующую в биосинтезе жирных кислот, служила ДНК Escherichia coli. Клонирование гена осуществляли методом продолжительной перекрывающейся ПЦР (ПП-ПЦР) [4, 5]. На первом этапе ген выделяли методом ПЦР с использованием «Phusion High-Fidelity»-ДНК-полимеразы («Fermentas», Литва) и двух олигонуклеотидных праймеров: TriclF (5'-ATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGGGTTTTCTTTCCG-3') и TriclR (5'-TGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTATTTCAGTTCGAGTTC-3'). На 5'-окончания праймеров были добавлены последовательности, комплементарные плазмиде pXcmkn12 (выделены подчеркиванием). Амплификацию осуществляли по следующей программе: этап предденатурации 2 мин при 95^oС; 25 циклов амплификации ‒ 30 с при 95^oС, 30 с при 50^oС, 40 с при 72^oС; финальная элонгация – 2 мин при 72^оС. На втором этапе линеаризовали плазмиду методом ПЦР с использованием «Phusion High-Fidelity»-ДНК-полимеразы и двух олигонуклеотидных праймеров: pXCMlinF (5'-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTT-3') и pXCMlinR (5'-ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAG-3'). Амплификацию вектора осуществляли по программе: этап предденатурации 2 мин при 95^oС; 25 циклов амплификации ‒ 30 с при 95^oС, 30 с при 55^oС, 2 мин при 72^oС; финальная элонгация – 2 мин при 72^оС. На третьем этапе собирали линеаризованный вектор и ген методом ПП-ПЦР по следующей программе: этап предденатурации 2 мин при 95^oС; 16 циклов: 30 с при 95^oС, 30 с при 55^oС, 2 мин при 72^oС; финальная элонгация – 2 мин при 72^оС. На этом этапе в качестве матрицы и затравки использовались фрагменты, полученные на первых двух этапах. Все продукты амплификации анализировали при помощи агарозного гель-электрофореза.

Синтезированным с помощью ПП-ПЦР продуктом трансформировали компетентные клетки E. coli DH5α, полученные стандартным кальциевым методом, c последующим высевом на плотную питательную среду LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl), с добавлением триклозана (1 мкМ). В результате была создана конструкция, обозначенная pXTri.

Результаты и их обсуждение. С помощью методов генной инженерии на основе многокопийного вектора pXcmkn12 сконструирована плазмида pXTri, в которой ген устойчивости к ампициллину заменен на ген fabI, кодирующий одну из редуктаз E. coli, участвующей в биосинтезе жирных кислот. В результате повышенной экспрессии данного белка клетки, несущие плазмиду, способны расти на питательной среде, содержащей триклозан. На рисунке 1 схематически изображены векторные конструкции pXcmkn12 и pXTri.

Рисунок 1. Схемы векторов pXcmkn12 и pXTri

Для подбора оптимальной концентрации триклозана, позволяющей селективно отбирать клетки, содержащие целевую плазмиду, клетки E. coli BLR(DE3), трансформированные плазмидой pXTri, выращивали на богатой питательной среде ZYM505, с добавлением триклозана до конечной концентрации 0,75, 1, 1,5 или 2 мкМ, а также на минимальной питательной среде ММ, подобранной ранее, с добавлением триклозана до 0,1, 0,25, 0,5 или 1 мкМ.

В качестве контроля использовали клетки E. coli BLR(DE3), трансформированные исходной плазмидой pXcmkn12. Эффективность селекции оценивали по оптической плотности клеток, достигаемой через 16 ч культивирования. Полученные данные суммированы в таблице 1.

Из представленных данных видно, что оптимальная концентрация триклозана, позволяющая селективно отбирать клетки, содержащие целевую плазмиду, составила 0,75 мкМ при выращивании на богатой питательной среде ZYM505 и 0,1 мкМ для минимальной питательной среды ММ.

Таблица 1

Подбор концентрации триклозана, позволяющей селективно отбирать клетки, несущие плазмиду pXTri

	Среда ZYM-505		Среда MM
Концентрация триклозана, мкМ	OD600		Концентрация триклозана, мкМ	OD600
	pXcmkn12	pTricl		pXcmkn12	pTricl
0,75	0,26±0,01	9,91±0,45	0,1	0,136±0,01	5,23±0,25
1	0,25±0,01	8,64±0,32	0,25	0,105±0,01	4,1±0,16
1,5	0,23±0,01	3,03±0,14	0,5	0,07±0,01	0,93±0,04
2	0,25±0,01	2,19±0,09	1	0,09±0,01	0,14±0,01

Полученный вектор можно использовать для создания плазмид (например, обогащенных иммунотропными CpG-мотивами), для которых наличие генов устойчивости к антибиотикам является нежелательным.

Литература:

1. Brito L., Chadwick S., Amiji M. Gelatin-based DNA delivery systems // Biodrug Delivery Systems: Fundamentals, Applications, and Clinical Development / Ed. by M. Morishita, K.Park. 2010. New York-London, Informa Healthcare Inc. P. 323‒340.

2. Coban C., Kobiyama K., Aoshi T., Takeshita F., Horii T., Akira S., Ishii K.J. Novel strategies to improve DNA vaccine immunogenicity // Curr. Gene Ther. 2011. Vol. 11. P. 479‒484.

3. Ghanem A., Healey R., Adly F.G. Current trends in separation of plasmid DNA vaccines: A review // Analyt. Chimica Acta. 2013. Vol. 760. P. 1–15.

4. Quan J., Tian J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways // PLoS ONE. 2009. Vol. 4, N 7. e6441.

5. You C., Zhang X.Z., Zhang Y.H. Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis // Appl. Environ. Microbiol. 2012. Vol. 78, N 5. P. 1593–1595.