Коровашкина А.С., Рымко А.Н., Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НАНОРАЗМЕРНЫХ ЧАСТИЦ, СОДЕРЖАЩИХ ПЛАЗМИДЫ, ОБОГАЩЕННЫЕ CPG-МОТИВАМИ

Введение. Бактериальная ДНК способна активировать иммунитет человека и животных, благодаря наличию в ее составе неметилированных CpG-динуклеотидов [1]. Созданные с применением генно-инженерной техники препараты плазмидной ДНК (пДНК), обогащенной CpG- динуклеотидами (CpG-пДНК), являются перспективными лекарственными средствами, но ввиду низкой стабильности пДНК в русле крови, необходима разработка эффективных способов её доставки в клетки-мишени. Среди кандидатов в переносчики пДНК рассматриваются наночастицы (НЧ) на основе неорганических слоистых двойных гидроксидов (СДГ) [2]. Структуру СДГ описывают в виде металл-гидроксидных слоев, в которых часть дивалентных катионов изоморфно замещена на катионы тривалентные, что приводит к возникновению на слоях положительных зарядов. Эти заряды компенсируются за счет интеркаляции гидратированных анионов в межслойное (галерейное) пространство [3].

В ряде работ для транспорта лекарственных соединений предложено использовать НЧ на основе белков, таких как человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) и желатин, благодаря их высокой биосовместимости, отсутствию токсичности и слабой антигенности [4].

Из ЧСА достаточно легко получать НЧ желаемого размера [5]. Для этого используется метод десольватации этанолом. Метод позволяет связывать различные молекулы путем встраивания, абсорбции или посредством ковалентного связывания с поверхностью НЧ. В 2005 году НЧ на основе ЧСА, содержащие цитостатик ‒ паклитаксел, были одобрены для практического применения Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA) США [6].

Целью настоящей работы явилось получение НЧ на основе слоистых двойных гидроксидов и ЧСА и изучение возможности получения их комплексов с CpG-пДНК.

Объекты и методы исследования. CpG-пДНК, содержащую 96 повторов иммуностимулирующего мотива GTCGTT, нитратную форму СДГ, а также комплекс СДГ-пДНК, получали как описано нами ранее [7, 8]. Для получения ЧСА-НЧ к 2 мл этанола по каплям при перемешивании добавляли 1 мл раствора ЧСА со скоростью 1 мл/мин. К полученной суспензии белка добавляли 20 мкл раствора 10% глутарового альдегида и инкубировали 12 ч при перемешивании. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием при 20 000 g в течение 20 мин [9].

Для включения пДНК в состав ЧСА-НЧ к 1 мл 2% раствора ЧСА добавляли 30 мкг плазмиды pCpG-KH11. Дальнейшее приготовление ЧСА-НЧ проводили как описано выше.

Размер полученных НЧ определяли с использованием прибора «Partical Size Analyzer 90Plus» («Brookhaven Instruments Co», США). Определение включения пДНК в состав НЧ проводили с помощью агарозного гель-электрофореза.

Результаты и обсуждение. Начальный этап работы был посвящен получению НЧ на основе СДГ магния и алюминия, а также ЧСА. Отмытые НЧ ресуспендировали в дистиллированной воде. Получали прозрачный, слегка опалесцирующий раствор. Результаты экспериментов по измерению размера полученных НЧ иллюстрирует рис. 1.

Из рис. 1 видно, что средний диаметр исследуемых частиц составляет 227,5 нм для СДГ-конструкций и 280,3 нм для частиц на основе ЧСА.

Рис. 1. Определение размера НЧ, полученных из СДГ (А) и ЧСА (Б)

Таким образом, полученные частицы действительно являются наноразмерными и, следовательно, могут быть использованы для наноструктурирования иммуностимулирующей пДНК.

На следующем этапе изучали возможность иммобилизации пДНК в НЧ. Контроль включения плазмиды pCpG-KH11 в СДГ- и ЧСА-НЧ проводили с помощью агарозного гель-электрофореза. Полученные данные представлены на рис. 2. Прежде всего видно, что после включения в наноразмерные комплексы пДНК не разделяется с носителем в агарозном геле, а остается на старте. Кроме того, из рис. 2 следует, что вся пДНК включена в состав НЧ.

При суспендировании НЧ из ЧСА-пДНК в воде образуется гомогенный опалесцирующий раствор, а НЧ из СДГ-пДНК формируют белые хлопьевидные агрегаты. Мы предположили, что при включении отрицательно заряженной пДНК в состав СДГ они теряют свой заряд и агрегируют. Следовательно, комплексы СДГ-пДНК представляют собой агрегаты наноразмерных частиц.

Рис. 2. Электрофореграмма плазмиды pCpG-KH11 до (1) и после иммобилизации в НЧ на основе СДГ (2) и ЧСА (3)

С другой стороны, белковые молекулы имеют значительно более сложную структуру и при иммобилизации пДНК на НЧ на основе ЧСА они не агрегируют и представляют собой гомогенный опалесцирующий раствор.

Из рис. 3 видно, что размер полученных комплексов ЧСА-пДНК в среднем составляет 168,3 нм.

Рис. 3. Определение размера комплекса ЧСА-пДНК

Таким образом, в результате выполнения работы получены на основе СДГ магния и алюминия, а также ЧСА наноразмерные конструкции, содержащие плазмиду pCpG-КН11, которые в дальнейшем могут быть использованы для изучения ее иммуностимулирующих свойств.

Литература:

1. Krieg, A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects / A.M. Krieg // Annu. Rev. Immunol. ‒ 2002. ‒ Vol. 20. ‒ P. 709‒760.

2. Choi, S.J. Anticancer drug-layered hydroxide nanohybrids as potent cancer chemotherapy agents / S.J. Choi, J.M. Oh, J.H. Choy // J. Phys. Chem. Solids. ‒2008. ‒Vol. 69, № 5-6. ‒P. 1528–1532.

3. Sugar–anionic clay composite materials: intercalation of pentoses in layered double hydroxide / S. Aisawa [et al.] // J. Solid State Chem. ‒ 2003. ‒ Vol. 174, № 2. ‒ P. 342–348.

4. Cellular uptake, antitumor response and tumor penetration of cisplatin-loaded milk protein nanoparticles / X Zhen [et al.] // Biomaterials. – 2013. – Vol. 34, № 4. – P. 1372–1382.

5. Human serum albumin (HSA) nanoparticles stabilized with intermolecular disulfide bonds / W. Wang [et al.] // Chem. Commun. – 2013. – Vol. 49. – P. 2234–2236.

6. Phase III trial of nanoparticle albumin-bound paclitaxel compared with polyethylated castor oil-based paclitaxel in women with breast cancer / W.J. Gradishar [et al.] // J. Clin. Oncol. – 2005. – Vol. 23. – P. 7794–7803.

7. Коровашкина, А.С. Создание штамма Escherichia coli ‒ продуцента плазмидной ДНК, обогащенной иммунотропными СрG-мотивами / А.С. Коровашкина, С.В. Квач, А.И. Зинченко // Стремления ‒ 2011: сб. материалов II Междунар. научн.-практ. конф. мол. ученых, Минск, 14‒18 ноября 2011 г. Минск, Беларуская наука, 2011. ‒Т.1. ‒ С. 184‒187.

8. Использование комплексов слоистого двойного гидроксида для иммобилизации плазмид, обогащенных CpG-мотивами / А.Н. Рымко [и др.] // Dynamika naukowych badan – 2012: materialy VIII Miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji, Przemysl, 07–15 lipca 2012. – Vol. 19. – S. 28–32.

9. Human serum albumin nanoparticles for delivery of Cu, Zn superoxide dismutase gene / Y. Mo [et al.] // Mol. Vision. 2007. Vol. 13. P. 746–757.