Рымко А.Н., Коровашкина А.С., Квач А.С., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗОКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИДКИНАЗЫ DROSOPHILA MELANOGASTER

Дезоксинуклеозидкиназа (КФ 2.7.1.145, ДН-киназа), продуцируемая клетками Drosophila melanogaster, катализирует (в отличие от бактериальных нуклеозидкиназ) фосфорилирование всех четырех природных 2′-дезоксинуклеозидов до 2′-дезоксинуклеозид-5′-монофосфатов [1, 2]. Широкая субстратная специфичность этого фермента открывает возможность его использования на начальном этапе трансформации всех четырех природных 2′-дезоксинуклеозидов в необходимые для постановки ПЦР 2′-дезоксинуклеозид-5′-трифосфаты [3], а также оказывается полезной при изучении механизма действия некоторых противоопухолевых и противовирусных нуклеозидов.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы было создание рекомбинантного штамма Escherichia coli, продуцирующего ДН-киназу D. melanogaster и изучение ее физико-химических свойств.

Объекты и методы исследования. Источником гена ДН-киназы (dnk; GI:42273, GenBank) служила геномная ДНК D. melanogaster, выделенная стандартным методом. Ген собрали из трех экзонов с помощью метода перекрывающейся ПЦР с использованием Pfu-ДНК-полимеразы (Promega, США) и шести олигонуклеотидных праймеров: Dm-dnkF1 (5¢-CAGTAACATATGGCGGAGGCAGCATCC-3¢), Dm-dnkR1 (5¢-CGAAGCAATAGCGAGCGCTAAAAATGGAGCG-3¢), Dm-dnkF2 (5¢-TTAGCGCTCGCTATTGCTTCGTGGAGAACATGC-3¢), Dm-dnkR2 (5¢-CGAGGACTAGGACCTTGCACGACTGCGGTC-3¢), Dm-dnkF3 (5¢-TCGTGCAAGGTCCTAGTCCTCGATGCCGATCTG-3¢) и Dm-dnkR3 (5¢-ATCTCGAGTCTGGCGACCCTCTGGC-3¢) (Праймтех, Беларусь). На следующем этапе ген dnk клонировали в векторе pET42b+ (Novagen, США) в клетках E. coli BL21(DE3) (Novagen, США) по стандартной методике. В результате получен штамм, продуцирующий ДН-киназу D. melanogaster, несущую на С-конце дополнительный октагистидиновый олигопептид. Клетки-трансформан-ты выращивали, проводили индукцию синтеза белка 1 мМ изопропил-β-тиогалактопиранозидом и продолжали культивирование в течение 3 ч. По окончании культивирования выделение рекомбинантного белка из клеток проводили по стандартной методике с помощью металло-аффинной хроматографии на смоле Ni-NTA (Sigma-Aldrich, США) согласно инструкции фирмы изготовителя.

Активность ДН-киназы определяли по скорости фосфорилирования дезокситимидина. Реакционную смесь, содержащую 50 мМ Трис-НСl-буфер (рН 8,5), 15 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 5 мМ АТФ, 2 мМ дезокситимидин и фермент, инкубировали при 30^oС. Ход реакции контролировали с помощью ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое обеспечивало образование 1 мкмоль продукта при 30 ^оС за 1 мин протекания реакции.

Результаты и обсуждение. Ген dnk, кодирующий ДН-киназу D. melanogaster, встраивали в плазмиду рЕТ42b+ под контролем сильного Т7-промотора. К 3′-концу кодирующей цепи гена добавляли нуклеотидную последовательность, кодирующую гистидиновый октапептид, выполняющий роль аффинного домена. В результате впервые создан штамм-продуцент рекомбинантной ДН-киназы (E. сoli КНК-12/3), молекула которой содержит дополнительный гистидиновый октапептид. При индукции синтеза рекомбинантной ДН-киназы в клетках полученного штамма доля ДН-киназы D. melanogaster составила 57% от общего клеточного белка (согласно ДСН-электрофореза).

Термостабильность биокатализатора является ключевым фактором при подборе оптимальных условий проведения биотехнологических синтезов. При изучении термостабильности ДН-киназы ферментный препарат прогревали при температурах 27–42^оС с шагом 5^оС на протяжении 4 ч в присутствии субстрата (АТФ) с последующим измерением остаточной активности ДН-киназы. Результаты, полученные в эксперименте, представлены на рисунке 1.

Рисунок 1. Влияние прогрева на активность ДН-киназы

при 42^оС (1), 37^оС (2), 32^оС (3), 27^оС (4).

Из рисунка 1 видно, что ДН-киназа быстро инактивируется при температуре 42 ^оС. Свою максимальную активность фермент проявляется при 37 ^оС, однако уже через 2 ч инкубирования при данной температуре фермент теряет около 50 % своей начальной активности. Наибольшую стабильность фермент проявляет при 27–32 ^оС, однако при 32 ^оС активность ДН-киназы в среднем на 20 % больше.

Изучение влияния pH на активность ДН-киназы проводили в 100 мМ Трис-HCl-буфере в диапазоне значений рН 7,0–9,0. Установлено, что максимальную активность ДН-киназа проявляет при значении рН равном 8,5, что не совпадает с литературными данными, согласно которым оптимальное значение рН для работы данного фермента составляет 7,5 [4, 5].

Известно, что ионы двухвалентных металлов играют ключевую роль в функционировании каталитического центра большинства ферментов, осуществляющих реакцию фосфорилирования. Однако данных о зависимости активности ДН-киназы от концентрации ионов двухвалентных металлов в доступной нам литературе нами не найдено.

Изучено влияние Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ и Fe²⁺ на активность фермента. Результаты эксперимента показывают, что наибольшей удельной активностью ДН-киназа обладает в присутствии ионов Mg²⁺. Оптимальная концентрация ионов Mg²⁺ для функкционирования фермента составляет 10 мМ.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов создан штамм E. сoli КНК-12/3 ‒ продуцент ДН-киназы D. melanogaster. Показано, что максимальную активность фермент проявляет при температуре 37 ^оС, рН 8,5 и в присутствии ионов Mg²⁺ в концентрации 10 мМ. Полученные результаты открывают перспективу использования ДН-киназы для проведения ферментативного фосфорилирования природных нуклеозидов и их производных.

Литература:

1. Munch-Petersen, B. Four deoxynucleoside kinase activities from Drosophila melanogaster are contained within a single monomeric enzyme, a new multifunctional deoxynucleoside kinase / B. Munch-Petersen, J. Piskur, L. Sondergaard // J. Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273, N 7. – P. 3926–3931.

2. Mikkelsen, N.E. Structural studies of nucleoside analog and feedback inhibitor binding to Drosophila melanogaster multisubstrate deoxyribonucleoside kinase / N.E. Mikkelsen, B. Munch-Petersen, H. Eklund // FEBS J. – 2008. – Vol. 275. – P. 2151–2160.

3. Knecht, W. Identification of residues involved in the specificity and regulation of the highly efficient multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster / W. Knecht, B. Munch-Petersen, J. Piskur // J. Mol. Biol. – 2000. – Vol. 301, N 4. – P. 827–837.

4. Active site mutants of Drosophila melanogaster multisubstrate deoxyribonucleoside kinase / N. Solaroli [et al.] // Eur. J. Biochem. – 2003. –Vol. 270 N 13. – P. 2879–2884.

5. Investigation of the substrate recognition of Drosophila melanogaster nucleoside kinase by site directed mutagenesis / N. Solaroli [et al.] // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids – 2004. – Vol. 23. – P. 1527–1529.