Береснев А

Береснев А.И., Ерошевская Л.А., Квач С.В., Кузьмина О.Н., Романова Л.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИНЕТИНРИБОЗИДА

Введение. Кинетинрибозид – модифицированный нуклеозид, который обладает цитотоксической активностью в отношении опухолевых клетках мышей, человека и растений [1–4] и, поэтому, может быть использован для производства соответствующих противоопухолевых средств.

Химические методы синтеза кинетинрибозида характеризуются многостадийностью и низкими выходами [5, 6].

Известен способ получения кинетинрибозида [7], заключающийся в замене урацила в молекуле уридина на кинетин при последовательном действии двух ферментов – уридинфосфорилазы и пуриннуклеозид-фосфорилазы (ПНФазы) Escherichia coli. Процесс ведут в присутствии клеток при 60°С в фосфатном буфере (рН 7,6). Выход реакции синтеза целевого продукта в работе не указан и рассчитать его не представляется возможным.

В работе [8], кинетинрибозид получают путем замены гуанина в молекуле гуанозина на кинетин под действием ПНФазы рекомбинантного штамма E. coli. Гуанозин и кинетин берутся в молярном соотношении 1,5−3:1. Процесс ведут при 50°С в фосфатном буфере (рН 7,0). Данные о выходе реакции синтеза целевого продукта в работе не приведены.

Из известных способов получения кинетинрибозида наиболее полно описан способ [9], заключающийся в том, что кинетин инкубируют при 37°С с гуанозином и ПНФазой из Aerobacter aerogenes в ацетатном буфере (рН 5,9), содержащем 2 мМ KH₂PO₄. При этом под действием фермента происходит вначале фосфоролиз гуанозина до α-D-рибозо-1-фосфата и гуанина, а затем замещение фосфата в молекуле α-D-рибозо-1-фосфата на кинетин с образованием кинетинрибозида и выделением неорганического фосфата в среду. Существенно, что обе реакции – фосфоролиз гуанозина и синтез целевого продукта являются обратимыми, и поэтому, ни один из субстратов не расходуется полностью. Выход реакции синтеза кинетинрибозида без выделения его из реакционной смеси составляет 78% в расчете на затраченный кинетин. Недостаток способа состоит в сравнительно невысоком выходе целевого продукта, который неминуемо должен дополнительно снизиться после изолирования его из многокомпонентной реакционной смеси.

Целью настоящей работы явилось повышение выхода кинетинрибозида, а также получение конечной реакционной смеси, не содержащей (кроме целевого продукта) других компонентов нуклеиновых кислот.

Объекты и методы исследования. В работе использовали сконструированный нами ранее рекомбинантный штамм E. coli [10], продуцирующий гомологичную ПНФазу. Получение посевного материала для ферментера проводили путем глубинного культивирования бактерий в двухлитровых колбах Эрленмейера, содержащих 0,5 л солевой питательной среды (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,05 М Na₂HPO₄, 0,05 М KH₂PO₄, 0,025 М (NH₄)₂SO₄, 0,75% (w/v) глицерин, 0,075% глюкоза, 2 мМ MgCl₂, 50 мкг/мл канамицин) на шейкере при 37^оС и 240‒250 об/мин.

В оптимизированных условиях (37^оС, скорость вращения мешалки 150 об/мин, объем подачи воздуха по отношению к объему питательной среды – 1:1, избыточное давление 0,1 атм) в ферментере Biotron LiFlus SP 60 L (Корея), содержащем 40 л солевой питательной среды с 0,5% триптона, проводили препаративную наработку бактериальных клеток. Культивирование штамма проводили до оптической плотности культуральной жидкости 5,0 (λ=600 нм), после чего вносили α-D-лактозу до концентрации 0,4%, снижали температуру до 25^оС и продолжали культивирование в течение 9 ч. По окончании процесса ферментации бактериальную биомассу осаждали центрифугированием с использованием центрифуги Avanti J-26XP (США) с проточным ротором при 20 000 g после чего ресуспендировали в 10 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,0).

Ферментативную активность ПНФазы определяли по скорости синтеза аденозина из аденина и инозина. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое способно образовать 1 мкмоль аденозина за 1 мин протекания реакции.

α-D-рибозо-1-фосфат синтезировали по известному методу [11].

Результаты и обсуждение. Указанная выше цель достигалась тем, что бариевую соль α-D-рибозо-1-фосфата (донор рибозного остатка) инкубировали в Трис-HCl-буфере (рН 7,5) с эквимолярным количеством кинетина (акцептор рибозного остатка) и бактериальной ПНФазой. При этом под действием фермента происходило замещение фосфата в молекуле α-D-рибозо-1-фосфата на кинетин с образованием кинетинрибозида. Схема синтеза представлена на рисунке.

BaHPO₄

α-D-рибозо-1-фосфат бария

Кинетинрибозид

Кинетин

ПНФаза

Рисунок 1 – Схема биокаталитического синтеза кинетинрибозида

Выбор рН реакционной смеси обуславливается тем, что при этих режимах ПНФаза E. coli проявляет максимальную активность.

В отличие от способа получения кинетинрибозида из кинетина и гуанозина, предложенного в работе [9], в настоящей работе в реакционную смесь донор вносится в виде бариевой соли этого органического фосфата. При этом фосфат, под действием фермента вытесняемый кинетином из α-D-рибозо-1-фосфата, выпадает в осадок в виде водонерастворимой бариевой соли. Это удаление из раствора неорганического фосфата (который требуется ПНФазе для фосфоролиза нуклеозидов) делает невозможным обратный процесс − фосфоролиз целевого продукта. Таким образом, реакция синтеза целевого продукта становится необратимой, что в результате приводит к практически 100%-ной трансформации исходного кинетина в кинетинрибозид.

Следует подчеркнуть, что процедура выделения целевого продукта из конечной реакционной смеси в предлагаемом техническом решении должна значительно упроститься, поскольку из продуктов реакции в конечном растворе находится практически только кинетинрибозид, в отличие от реакционной смеси, получаемой согласно сообщению [9], где кроме целевого продукта присутствуют остатки непрореагировавших исходных субстратов, неорганический фосфат, а также α-D-рибозо-1-фосфат (промежуточный продукт) и гуанин (побочный продукт).

При получение кинетинрибозида в оптимальных условиях проведения процесса смесь (20 мл), содержащую: 43 мг кинетина (10 ммоль), 76,4 мг бариевой соли α-D-рибозо-1-фосфата (10 ммоль), ПНФазу (200 ед. активности), 50 мМ Трис-HCl-буфер (рН 7,5), инкубировали при 37^оС с перемешиванием. Ход реакции контролировали с помощью тонкослойной хроматографии. Спустя 60 мин количество образовавшегося целевого продукта в расчете на внесенный кинетин составило 99,6 мол.%. После центрифугирования выделение целевого продукта из полученного супернатанта проводили с использованием адсорбционной хроматографии на колонке с силикагелем, согласно известного метода [8]. В результате получили 66,98 мг целевого вещества, что соответствует 92%-ому выходу в расчете на взятый в реакцию кинетин. При хроматографировании на тонкослойных пластинках "Silufol-UV₂₅₄" фирмы "Serva" (Германия) в системе растворителей хлороформ - этиловый спирт в соотношении 4:1 (об/об), подвижность целевого продукта совпадала с Rf контрольного препарата кинетинрибозида фирмы «Sigma» (США).

Т. пл. целевого продукта 152–154^оС; лит. данные [5]: 151‒153^оС.

УФ-спектр: (рН 7), l_макс нм (e): 268 (19000); (рН 1), l_макс нм (e): 267 (18500); (рН 13), l_макс нм (e): 269 (19100).

Литература:

1. Griffaut B., Bos R., Maurizis J.C. et al. Cytotoxic effects of kinetin riboside on mouse, human and plant tumour cells // Int. J. Biol. Macromol. 2004. Vol. 34. P. 271–275.

2. Tiedemann R.E., Mao X., Shi C.X. et al. Identiﬁcation of kinetin riboside as a repressor of CCND1 and CCND2 with preclinical antimyeloma activity // J. Clin. Invest. 2008. Vol. 118. P. 1750–1764.

3. Rajabi M., Gorincioi E., Santaniello E. Antiproliferative activity of kinetin riboside on HCT-15 colon cancer cell line // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids. 2012. Vol. 31, N 6. P. 474−481.

4. McDermott S.P., Eppert K., Notta F. et al. A small molecule screening strategy with validation on human leukemia stem cells uncovers the therapeutic efficacy of kinetin riboside // Blood. 2012. Vol. 119, N 5. P. 1200−1207.

5. Patent N 3150124 US, 1964.

6. Kissman H.M., Weiss M.J. Kinetin riboside and related nucleosides // J. Org. Chem. 1956. Vol. 21, N 9. P. 1053−1055.

7. Mikhailopulo I.А., Kvasyuk Е.I., Lyakhovets V.I., Popov I.L., Eroshevskaya L., Barai V.N., Zinchenko A.I. Synthesis of kinetin riboside and its 5ʹ-monophosphate by immobilized bacterial cells // Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 1984. N 14. P. 291.

8. Roivainen J., Elizarova T., Lapinjoki S., Mikhailopulo I.A., Esipov R.S., Miroshnikov A.I. An enzymatic transglycosylation of purine bases // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids. 2007. Vol. 26, N 8-9. P. 905−909.

9. Patent N 1063951 GB, 1967.

10. Патент № 13127 BY, 2010.

11. Sakai T., Tochikura T., Ogata K. Metabolisms of nucleosides in bacteria // Agric. Biol. Chem. 1966. Vol. 30, N 3. P. 245−253.