ХИМИЯ И ХИМИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ/4. Химико-фармацевтическое производство

К.т.н., доц. Поводзинський В.М., к.т.н., доц. Ружинська Л.І.,

Шибецький В.Ю., Костик С.І., Резенчук О.Є.

Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут»

Роллерний ферментер для культивування клітинних культур

1. Вступ

Сучасна фармацевтична біотехнологія при виробництві імунобіологічних лікарських засобів або активних фармацевтичних інгредієнтів таких як цитокіни, гормони, вакцини, моноклональні антитіла орієнтована на культивування еукаріотичних клітин.

Суттєвим обмеженням у проведенні масового суспензійного культивування в штучно створених умовах in vitro є необхідність збереження стабільності умов зовнішнього оточення суттєвим елементом яких є регульовані гідродинамічні та масообмінні характеристики ферментеру. Ця умова особливо актуальна при масштабуванні ферментерів [1].

Для культивування аеробних біологічних агентів в суспензійному режимі розроблені ферментери з дифузійним типом аерації і регульованим рівнем інтенсивності руху газорідинної дисперсії, що забезпечує гомогенність культуральної рідини і відсутність градієнтів по температурі, рН, концентрації субстрату і метаболітам.

Культивування клітинних культур суттєво відрізняється від культивуванння мікроорганізмів високими вимогами до забезпечення асептичності, необхідністю регулювання інтенсивності перемішування при суворих вимогах до газового балансу та стану газової фази.

Специфічною особливістю клітинних культур є несприйняття бульбашкової газової фази, так як деформація бульбашок, їх руйнування та коалесценсія має інгибуючу дію на клітинні культури. При цьому практично всі клітинні культури є опорнозалежними і в стаціонарних умовах клітини імобілізуються на поверхнях внутрішніх елементів ферментеру [2].

2. Постановка задачі

Висока фенотипічна індивідуальність клітинних культур обумовлюється повільним ростом клітин та їх високою травматичністю.

Для реалізації специфічних клітинних культур ферментери традиційних типів непридатні зважаючи на обмеженість способів перемішування (обертові та вібраційні імпелери) та наявність бульбашкової аераційної газової фази. Мало придатні для промислових процесів і класичні роллерні ферментери, що поширені в практиці культивування клітинних культур і в яких неможливо досягти економічно доцільних титрів клітин.

Найбільш популярним типом культур клітин у технологіях вірусних препаратів та тканевих культур є монослойні одношарові стаціонарні культури які як правило культивуються у ролерних системах. Такий тип культивування дозволяє створити економічно рентабельні установки підвищивши титр клітин від 10⁶, для суспензійних культур до 10⁸ − 10⁹ що простежується для імобілізованих культур [2].

У даній ситуації, зважаючи на вище наведене виникає задача по розробці конструкції ферментеру ролерного типу з носіями для імобілізації клітин без традиційних систем барботажної аерації.

3. Огляд існуючих рішень поставленої задачі

Для культивування опорнозалежних клітин, як правило використовуються ферментери з розвиненою питомою поверхнею вбудованих механічних конструкцій або на поверхні носіїв на яких імобілізується монослойні одношарові стаціонарні культури.

Відоме сучасне рішення для культивування клітин на мікроносіях, яке забезпечує формування моношару на поверхні часток диаметром 160-230 мк, за рахунок отримання значної питомої поверхні. Мікрочастки з імобілізованими клітинами рівномірно заповнюють внутрішній об’єм ферментеру, і це дозволяє досягти високих титрів. Для реалізації такого рішення, щодо конструкції ферментеру потрібні елементи, що виготовлені з відповідного полімерного матеріалу. Але таке технічне рішення не виключає прямого контакту клітин з бульбашками газової фази і залишає відкритим питання про вивантаження-завантаження мікроносіїв з поверхневим шаром клітин, при цьому не виключається контакт клітин з потоками від перемішуючого пристрою і аераційною газовою фазою. В даній ситуації привертають увагу можливості конструкцій, що розроблені компанією Autoclave Engineers для хімічних каталітичних реакторів Берті, Махоні-Робінсона, та реактора Карберрі з обертовими і нерухомими корзинами для каталізатора.

Для захисту гранул носія та поверхні клітинного шару доцільне використання корзин – касет всередині яких знаходяться носії імобілізованих клітин, конструкції яких відомі в практиці абсорбції, наприклад нерегулярні насадки – кільця Рашига, Палля, Лессинга, сідловидні насадки Берля або Інталлокс з питомою поверхнею 110-330м²/м³.

а б в

Рис. 1 Роллерний ферментер для культивування клітинних культур [3]

а – розріз апарата; б – вигляд зліва; в – тип насадок.

Ферментер має жорстку конструкцію, складається з корпусу, кришки 1 та сорочки 2. Корпус складається з циліндричної обичайки 3 і привареної до неї плоскої кришки 4 з одного боку і фланця 5 з іншого. Використання плоскої кришки 4 є оптимальним для даної конструкції, через те, що в апараті відсутній значний надлишковий тиск і така кришка є достатньо дешевою і простою у виготовленні.

Герметизація апарата в місці з’єднання корпуса і кришки 1 забезпе-чується за рахунок притискання кришки апарата до фланця 5 болтами 6, а в якості ущільнення використано асбометалічну прокладку 7. Герметизація апарата в місці входу вала 8 в кришку 1 здійснюється шляхом використання гілонового ущільнення 9.

Регулювання температури культивування здійснюється за рахунок сорочки 2, привареної до корпуса, в яку може подаватися теплоносій з потрібною температурою. Процес керується за рахунок наявності зворотного зв’язку між датчиком температури 10 в середині апарата і механізмами регулюючими подачу холодної і гарячої води. Площа поверхні теплообміну сорочки забезпечує необхідну кількість теплоти для підтримання постійної температури культивування.

На верхній частині циліндричної обичайки 3 корпуса апарата розташовані штуцер подачі поживного середовища 11. В нижній частині апарата знаходиться штуцер для виходу культуральної рідини 12.

Стерильне повітря на аерацію підводиться через штуцер входу 13 на верхній частині корпуса і формує газову демпферну зону. Воно попередньо підігрівається до температури , щоб забезпечити стабільний термічний фон. Відведення повітря здійснюється через штуцер виходу 14, що також розташований на верхній частині корпуса апарата. В процесі роботи при обертанні касети поживне середовище повільно перетікає через поверхню носіїв імобілізованих клітин, що знаходяться в касеті. Аерація імобілізованого клітинного шару забезпечується за рахунок дифузії кисню повітря з газової фази в культуральну рідину та під час занурення шару насадки у культуральну рідину. Ступінь заповнення апарата культуральною рідиною складає 20 %.

Кришка 1 представляє собою плоску кришку, через яку вводиться вал в апарат. На валу апарата закріплена касета 15. В порожнину касети апарата, що обертається завантажують таку кількість насадок 16, що дозволяє сформувати моношар клітин, з концентрацією клітин 10⁶ до 10⁸ . Насадки засипають між стінками касети так, що збезпечується їх нерухомість і унеможливлюється механічне ушкодження моношару клітин. Касета обертається на валу за рахунок передачі крутного моменту від вала двигуна до вала апарата через муфту 17. Для вивантаження утвореної клітинної маси касета від’єднується від кришки і від корпусу і знімається з вала апарата. Апарат встановлюється на двох сідловидних опорах 18.

Матеріал апарата хромонікелева сталь аустенітного класу 12Х18Н10Т ГОСТ 380-94. Матеріалом насадок є кераміка, на якій можуть іммобілізуватися клітини, і яка є інертною у хімічному відношенні.

Список літератури

1. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев Л.С. Моделирование биохимических реакторов. – М.: Лесная пром.-сть, 1979.− 344 с.

2. Сергеев В.А., Собко Ю.А. Культуры клеток в ветеринари и биотехнологии.-К.: Урожай, 1990.-152 с.

3. Патент України . Апарат для культивування клітинних культур. Патент № 72531 на корисну модель, Україна, МПК С12 М 1/04 (2006.01). U 2011.15652. – Заявл. 12.2011. Опубл. 27.08.2012. – Бюл. № 16.-5 с. Ружинська Л. І., Поводзинський В.М., Шибецький В. Ю., Костик С. І., Резенчук О. Є.