Особливості резистентних стафілококів, що утворюють біоплівки

Інфекційні захворювання викликані представниками грампозитивних коків (кокові інфекції) є важливою медико-біологічною проблемою. Стафілокок, як представник кокової, умовно патогенної мікрофлори, становить загрозу для людини, володіючи різноманітними факторами патогенності може персистувати в макроорганізмі, викликаючи запальні процеси. Одним із таких факторів – є утворення біоплівки, яка є складовою частиною життєвого циклу стафілококів і успішною стратегією захисту бактерій від несприятливих факторів середовища.

Стафілокок має дуже лабільний метаболізм, завдяки якому, бактерія може посилити захворювання від гострої до хронічної форми. Показано, що бактерії в біоплівках можуть обмінюватися плазмідами, що містять гени, відповідальні за їх резистентність до антибіотиків. Пеніцелазні плазміди золотистого стафілокока обумовлюють утворення активного ферменту пеніцилінази, який руйнує пеніцилін, що може спричиняти резистентність до антибіотиків пеніцелінового ряду.

Чутливість стафілококів до різних груп антибіотиків, з кожним роком, представляє собою все більшу проблему, так як стафілококи дуже швидко набувають резистентність до антибіотиків та пристосовуються до співіснування з ними. А набуваючи асоціації в біоплівка резистентність набуває набагато більших обертів. Тому мета цієї роботи ознайомитись зі здатністю стафілокока утворювати біоплівки та кореляція утворення біоплівки з антибіотикорезистентністю.

Стафілококові біоплівки - це фізичні структури, утворені мікробними спільнотами на поверхні розділу фаз: рідина (водне середовище) - тверда поверхня, рідина - повітря і т.д [5]. Біоплівки можуть формуватися стафілококами одного виду, або формують спільноти, що розвиваються з багатьох видів бактерій, а також можуть включати й інші мікроорганізми [2].

Стафілококова біоплівка - мікробне співтовариство, що складається з клітин, які прикріплені до поверхні або один до одного, укладені в матрикс синтезованих ними позаклітинних полімерних речовин; їх фенотип змінений порівняно з поодинокими, планктонними клітинами; у них змінені параметри росту та експресії специфічних генів[1,9].

При дослідженні нами, диско-дифузійним методом, резистентних стафілококів з різних біотопів (ніс, зів, кров, сеча) було виявлено утворення біоплівок. Причому, певної залежності формування біоплівок, від тієї чи іншої групи антибіотиків не спостерігалося. Утворення біоплівки проявляло резистентність відразу до різних мішеней дії, тобто до різних груп антибіотиків одночасно(Табл.1).

Табл.1 Особливості утворення біоплівки з антибіотикорезистентністю стафілококів

Назва штаму	Біотоп	Антибіотик, до якого проявлялась резистентність	Утворення біоплівки
S.aureus	ніс	оксацилін, ампіцелін, тетрациклін	+
S.aureus	ніс	ампіцелін	+
S.aureus	кров	амоксицилін, азітроміцин	+
S.aureus	кров	тетрациклін, гентаміцин,	±
S. haemolyticus	кров	еритроміцин	+
S.aureus	уретра	оксацилін, амоксицилін, доксіцилін	±
S. saprophyticus	уретра	оксацилін, ампіцелін, амоксицилін,	+
S. saprophyticus	уретра	оксацилін, ампіцелін, амоксицилін,	+
S.aureus	сеча	лінезолід, офлоксацин	+
S.epidermidis	сеча	амоксицилін, азітроміцин	+
S.aureus	сеча	доксіцилін, офлоксацин, норфлоксацин	+
S.capitis	зів	оксацилін, тетрациклін, офлоксацин, ципрофлоксацин	+
S.aureus	зів	оксацилін,	+
S.epidermidis	епідерміс	азітроміцин, норфлоксацин	+
S.epidermidis	епідерміс	амоксицилін,	+
S.aureus	кал	ампіцелін,	+
S.aureus	кал	оксацилін, норфлоксацин	+

У досліджені стафілококів на наступному етапі були додані антибіотики (ампіцелін, амоксицилін, азітроміцин, еритроміцин, доксіциклін, офлаксоцин, та норфлаксоцин), які додавались саме до тих штамів, які були попередньо резистентні до тих чи інших антибіотиків. Після вирощування чергової біоплівки, зміни в ній з’явились тільки у чотирьох штамів (Табл.2). Було відмічено збільшення або зменшення біоплівок або згущення структури біоплівки та зміна кольору.

Табл.2 Вплив антибіотиків на утворення біоплівки антибіотикорезистентних стафілококів

Штам	Біотоп	Утворення біоплівки резистентного штаму	Антибіотик, до якого проявлялась резистентність	Зміна в біоплівці
S.aureus	ніс	+	ампіцелін	Збільшення біо-плівки на 0,5 мм
S.aureus	кров	+	амоксицилін, азітроміцин	Біоплівка стала більш щільною та колір з біло-прозорого, змінівся на творожно-білий
S. haemolyticus	кров	+	еритроміцин	Зменшення біо-плівки на 0,3 мм
S.aureus	сеча	+	доксіцилін, офлоксацин, норфлоксацин	Збільшення на 0,1мм

Що ж призводить до антибіотикорезистентності у біоплівці ?

Слиз, який продукується деякими патогенами, заповнюючи міжклітинний простір в біоплівках, може володіти зв'язуючою антибіотик дією[7].

Полісахариди слизу S.еpidermidis, при дослідженні І.А. Хмеля, знижували антибактеріальну активність глікопептідних антибіотиків. А додавання екстракту цих полісахаридів до бульйону збільшувало мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) антибіотика ванкоміцину в кілька разів. 

Наявність біополімерних матриксів, оточуючих біоплівки, здатні перешкоджати дифузії поживних речовин, а також накопичення метаболітів за рахунок великої щільності клітин усередині біоплівок, створює для стафілококів в біоплівках умови росту з обмеженим доступом кисню і недостатньою кількістю продуктів харчування, подібні з умовами росту клітин у стаціонарній фазі[8]. Вважається, що по фізіологічному стану, по метаболічної активності клітини, що живуть в складі біоплівок, швидше схожі з клітинами стаціонарної фази росту, ніж з клітинами, активно зростаючими. Це може бути однією з причин підвищеної резистентності до несприятливих факторів стафілококів в біоплівках, т.к. відомо, що бактерії у фазі уповільнення зростання та стаціонарної стійкіші до дії антибактеріальних агентів. Дія більшості антибіотиків націлена на клітини, які активно діляться. Фактично всі антибактеріальні препарати більш ефективні відносно швидко зростаючих клітин. Пеніцилін і ампіцилін взагалі не знищують клітини, які не ростуть[4,11].

Приклад модифікації мішені, як причини антибіотикорезистентності біоплівочних бактерій була робота з мутантним штамом Staphylococcus aureus. Вважається, що відбулася мутація в кластері I гена rpoB, що кодує бета-ланцюг ДНК-залежної РНК-полімерази (основна мішень для рифампіцину), так як забезпечувала в дослідах in vivo резистентність стафілококової біоплівки до рифампіцину[9,10].

Ще одним з факторів стійкості стафілококових біоплівок може бути поява і розмноження в них клітин-персістерів (субпопуляційні резистентні клітини). Щоб проявити толерантність до антибіотику, в першу чергу на стафілокок впливає первинна дія антибіотика, після чого спостерігається метаболічний дисбаланс у бактеріальній клітині, що спричиняє порушення синтезу «антитоксину». Деградація «антитоксину» руйнує стійкий комплекс «токсин-антитоксин», після чого відбувається вивільнення «токсинів» (нелетальних), зв’язаних з мішенями і блокада метаболічних процесів у клітині. Так утворюються бактерії-персистори, які і є толерантними до того чи іншого антибіотику [9,12].

Фізична близькість клітин в біоплівках полегшує передачу плазмід в популяції бактерій. Показано що обмін плазмидами між різними видами Staphylococcus були значно вище в біоплівках, ніж для тих же мікроорганізмів в планктонній культурі. Таким чином, біоплівки можуть збільшувати поширення резистентних бактерій. Це особливо небезпечно в разі їх росту і розмноження в умовах стаціонару, оскільки вони здатні поширюватися від пацієнта до пацієнта[8].

Також нами були отримані дослідні дані висіяного S. capitis із зіву.
Цей штам, після диско – дифузійного методу проявив резистентність до оксаміцину (зона чутливості не спостерігалась взагалі). Інший виділений штам S. aureus, (чутливий до пеніцилінів, біотоп – ніс, утворив біоплівку діаметром в 1,2см) був суміщений з вище згаданим S. capitis. Після сумісного вирощування стафілококів на рідкому середовищі в планшеті, була виявлена біоплівка, яка збільшилася в розмірах (d= 1,3см).

S. aureus після дослідження був знову виділений в чисту культуру, і досліджений диско-дифузійним методом, виявилося, що мікроорганізм показав резистентність до всіх напівсинтетичним антибіотиків пеніцилінового ряду (амоксицилін, ампіцелін, оксацеллін), а також до деяких інших груп антибіотиків проявляючих антистафілококову дію (офлоксацин, норфлоксацин, гентаміцин).

З вище сказаного випливає те що, в даний час механізми підвищеної стійкості стафілококів в біоплівках до дії антибактеріальних агентів вивчені недостатньо. Аналіз наявних у літературі даних, а також власних досліджень дозволяє припускати, що регуляція підвищеної стійкості бактерій, що живуть в біоплівках, є мультифакторним процесом та потребує подальшого дослідження.

Використана література :

1. Бехало В.А., Бондаренко В.М., Сисолятін Є.В., Нагурський Є.В. Імунобіологічні особливості бактеріальних клітин медичних біоплівок. Журн. Мікробол 2010; 4: С.97-105.

2. Гостєв, В.В., Сидоренко С.В. Бактеріальні біоплівкі та інфекції. Журнал інфектол. 2010; 2 (3): С.4 -15.

3. Ігнатов В.В. Обмін речовин у стафілококів. Стафілококи та стафілококова інфекція. – Саратов. 1980. – с. 92-105

4. Ільїна, Т.С. Біоплівки, як спосіб існування бактерій у навколишньому середовищі і організмі господаря: феномен, генетичний контроль і системи регуляції їх розвитку. Т.С. Ільїна, Ю.М. Романова, А.Л. Гінцбург Генетика. - 2004. - № 40. - С.1-12.

5.Коробов В.П., Лемкина Л.М., Монахов В.И., Анализ чувствительности процес сов формирования биопленок Staphylococcus epidermidis 33 к некоторым факторам внешней среды Вестник пермского университета вып.1(1) 2010 С.54-67

6. Льюїс, К.П. Персистуючі клітини і загадка виживання біоплівок. Біохімія 2005, 70 (2) :С.327-36.

7. Плакун, В.К., Стрелкова, Е.А., Журіна, М.В. Персистенція і адаптивний мутагенез в біоплівках. Мікробіологія 2010; 79 (4): С.447-458.

8. Хмель І.А. Журнал МЕІ «Біоплівки бактерій та зв’язані з ними труднощі медицинської практики», 2009р. С.36-44

9. Чеботарь І.В., Маянський А.Н., Кончакова Є.Д., Лазарєва, А.В. Чистякова В.П. МЕИ «Антибіотикорезистентність біоплівочних бактерій» 2006р С.122-139

10. Costerton J. W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 1999; 284:1318-22.

11. Braz Dent J, Altieri KT, Sanitá PV, Machado AL, Giampaolo ET, Pavarina AC, Jorge JH, Vergani CE. Eradication of a Mature Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Biofilm From Acrylic Surfaces. 2013 Sep-Oct;24(5):487-491

12. Lee JH, Kim YG, Ryu SY. Ginkgolic acids and Ginkgo biloba extract inhibit Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus biofilm formation. Int J Food Microbiol. 2014 Mar 17;174:47-55.