Сидоренко Д.В., Сідашенко О.І., Воронкова О.С., Вінніков А.І.

Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара

 

ВПЛИВ ФАКТОРІВ СЕРЕДОВИЩА НА ФОРМУВАННЯ БІОПЛІВКИ

Сьогодні особливу увагу дослідники приділяють вивченню ролі бактеріальних біоплівок у навколишньому середовищі та їх впливові на організм людини. Біоплівка є своєрідною формою захисту мікроорганізмів від впливу факторів зовнішнього середовища і способом персистенції мікроорганізмів в організмі хворого та на об’єктах навколишнього середовища.

При переході клітин від планктонної до біоплівкової форми існування за рахунок експресії генів відбуваються фенотипічні зміни. Це дозволяє відрізнити мікробні співтовариства біоплівок від схожих на них лише зовні структур, наприклад, колоній бактерій, які ростуть на поверхні агару або кластерів. Екзогенний матрикс утворює біоплівковий бар’єр, що захищає бактерії від зовнішнього впливу.

Існування мікроорганізмів у складі біоплівок створює великі труднощі, так як при цьому значно підвищується стійкість бактерій до імунної системи господаря, антибактеріальних та дезинфікуючих засобів, впливу несприятливих факторів середовища, таких як низькі або високі значення pH, висока осмотична сила, температура тощо[2, 5, 6]. В зв’язку з цим, мішенню для впливу на інфекційний мікробний процес стають не тільки самі бактерії, але й утворювані ними біоплівки. Тому, розробка методів раціональної боротьби з патогенними мікроорганізмами має базуватися на детальному дослідженні не тільки їх метаболічних властивостей у планктонній культурі, але й вивчення властивостей бактерій у складі біоплівок.

    Метою нашої роботи було провести аналіз літературних даних, які пов’язані з вивченням впливу факторів навколишнього середовища на біоплівкоутворення.

Значну роль у захисті клітин, що входять до складу біоплівки, від факторів навколишнього середовища виконує екзополімерний матрикс. Так як саме позаклітинний матрикс біоплівки може обмежувати дифузію речовин і зв'язувати антимікробні препарати. Позаклітинні полімерні речовини, які є складовими матриксу, представляють собою дифузійний бар'єр для молекул антимікробних речовин. Це забезпечує резистентність клітин біоплівки до великих білкових молекул, таким як лізоцим і комплемент, а також до великих антимікробних пептидів та інших агентів. Цікавий приклад бар'єрної функції екзополісахаридів був описаний для пероксиду водню[9, 10]. На відміну від планктонних клітин, які чутливі до Н2О2 і гинуть при його концентрації 50 мкМ, бактерії у біоплівці були захищені, оскільки доза, що доходить до клітин біоплівки, фактично була нижча за рівень каталазної активності. 

      Особливий інтерес у складі біоплівок викликає наявність у їх складі так званих “клітин персистерів”, стійких до впливу як агресивних факторів середовища, так і антимікробних агентів. Феномен персистентності (persistence), тобто фенотипової властивості невеликої частини бактеріальної популяції зберігати життєздатність навіть у присутності летальних доз пеніциліну, був відкритий ще на початку “ери антибіотиків”. Механізму персистентності присвячено велику кількість досліджень, оскільки цей феномен грає надзвичайно важливу роль у хронічних мікробних інфекціях. У цих випадках лікування антибіотиками знищує у макроорганізмі переважну більшість планктонних, а також значну частину чутливих бактеріальних клітин у біоплівках. Однак клітин персистери, локалізовані у біоплівках, недоступні для імунної системи і після припинення антибіотикотерапії відновлюють розмноження, викликаючи повторний спалах інфекційного процесу. 

Складність дослідження метаболізму клітин персистерів полягає у проблемі отримання їх у кількості, достатній для проведення експериментів. Ця проблема частково вирішена у разі E. coli, оскільки вдалося ізолювати hip-мутант з підвищеним вмістом клітин персистерів. Локус hip включає два гени: hipA і hipB, що утворюють оперон  hipBA. У найбільш вивченого мутанта hipA7 кількість клітин персистерів може досягати 1% всієї популяції, тобто в 104 перевищувати їх кількість у дикого штаму[3, 11, 12]. У E. coli виявлений, ще один локус (hipQ), що відповідалє за підвищення вмісту клітин персистерів у популяції , проте ці мутанти менш вивчені. Для ізолювання клітин персистерів з мутантів hip розроблені два методи. Перший з них полягає в обробці ампіциліном клітин E. coli, що знаходяться в експоненційній фазі росту.

Показано, що існує два види клітин-персистерів: клітини персистери першого типу являють собою субпопуляцію клітин без росту, що виникла у стаціонарній фазі попереднього клітинного циклу, тому їх кількість пропорційна розміру інокуляту. До початку зростання ці клітини проходять тривалу (до 14 ч) лаг-фазу на відміну від звичайної лаг-фази тривалістю 40 хв. Клітини персистери другого виду виникають у процесі росту популяції. Їх частка залежить від числа клітин у культурі, але не залежить від розміру інокуляту. Популяція клітин дикого штаму містить, крім нормальних (чутливих до антибіотика клітин), також обидва з перерахованих видів клітин персистерів.

Останнім часом основна увага приділялася не тільки метаболічним відмінностям планктонних і біоплівкових культур, а також вивченню чутливості до стресових факторів. Одна з точок зору на причину формування біоплівок виходить з того припущення, що ці структуровані співтовариства є способом захисту мікроорганізмів від стресових умов [1, 4].

      Мікроорганізми у біоплівках стійкіші до різних стресових дій: лімітації субстратами, змінам рН, окисленню активними формами кисню. При рості у біоплівковій формі, за рахунок екзополімерних речовин, бактерії захищені від біоцидів, антибіотиків, антитіл, фагоцитів, поверхнево-активних речовин, бактеріофагів, ультрафіолетового випромінювання, зміни рН, висушування, а також є можливість збереження постійності умов існування (гомеостазу), у тому числі, шляхом зв'язування катіонів або токсинів [1, 7, 8].

     Окремі дослідження показали, що екзополісахаридний матрикс фізично запобігає доступу деяких антибактеріальних агентів у біоплівку, діючи як іонообмінник, обмежуючи таким чином поширення небажаних речовин з довкілля у біоплівку.

     Важливість досліджень біологічної дії електромагнітного випромінювання нині ні у кого не викликає сумнівів. Деякі електромагнітні випромінювання (ЕМВ) добре відомі і давно використовуються, наприклад, ультрависокочастотне (УВЧ), надвисокочастотне (НВЧ), інфрачервоне (ІЧ) і ультрафіолетове (УФ) випромінювання. ЕМВ інших частотних діапазонів, наприклад, украй високих частот, досліджуються і застосовуються порівняно нещодавно. Опромінення культури P.aeruginosa протягом15, 30 і 45 хвилин ЕМВ на 12 і 24 годині з моменту внесення інокуляту впливає на формування біоплівок.

Процес утворення біоплівок відбувається більше інтенсивно при 30 і 45 хвилинах експозиції. При дії ЕМВ на культуру P.aeruginosa впродовж 15 і 30 хвилин через 12 годин з моменту внесення інокулята утворення біоплівок, навпаки, зменшувалося при 30 і 45 хвилинах дії електромагнітним випромінюванням ЕМВ. При опроміненні ЕМВ синьогнійні палички через 24 години з моменту внесення інокулята інтенсивність біоплівкоутворення зменшилася при 30 і 45 хвилинній експозиції порівняно з неопроміненою культурою і культурою, яку піддавали опроміненню 12 годин з моменту внесення інокулята, 15 хвилинна дія електромагнітного випромінювання не впливала на процес плівкоутворення

Тому можна заключити, що опромінення культури бактерій P. aeruginosa ЕМВ впливає на процес біоплівкоутворення – відбувається зниження здатності формувати біолпівку та перехід у планктонну форму існування [7, 8, 12]. Це узгоджується з роботами, в яких показано, що сигналом для переходу від біоплівки до планктонної форми являється генерація оксиду азоту(II), - NO. Ця речовина у сублетальних концентраціях індукує дисперсію біоплівок. Штами, що втратили здатність до генерації NO у результаті втрати активності нітритредуктази, набагато гірше диспергують в анаеробних умовах. І, навпаки, штами, дефектні по NO-синтази відрізняються підвищеною схильністю до планктонного існування. Ключову роль у ньому грає регуляторний білок BdlA(Bdl – biofilm dispertion locus). І, навпаки, опромінення культури бактерій P.aeruginosa ЕМВ підвищує їх здатність до біоплівкоутворення. Таким чином, опромінення культури P. aeruginosa ЕМВ підвищує здатність мікроорганізмів до плівкоутворення, тоді як опромінення культури ЕМВ на частоті знижує здатність до плівкоутворення.

 

Заключення

     Значна кількість мікроорганізмів у природних і штучно створених середовищах існує у вигляді структурованих, прикріплених до поверхні угруповань – біоплівок. Біоплівки існують як у природі, так і в спорудах, створених людиною. Будова її різноманітна, вона може бути пронизана порами, пустотами і ходами, а товщина може досягати кількох сантиметрів.

     Вважається, що біоплівка – це асоціація мікроорганізмів, яка прикріплена до поверхні біогенного або абіогенного походження та об’єднана єдиним екзополімерним матриксом.

     Екзополімерний матрикс біоплівки може обмежувати дифузію речовин і зв'язувати антимікробні препарати. Позаклітинні полімерні речовини, складові матриксу, є дифузійним бар'єром для молекул антимікробних речовин.    

     Таким чином, детальне та глибоке вивчення динаміки формування біоплівки, біологічних властивостей та закономірностей функціонування мікроорганізмів, що входять до її складу дозволить вирішити ряд питань практичної та теоретичної біології і можливість пошуку лікарських препаратів, що можуть цілеспрямовано впливати на розвиток біоплівки, як у плані активації, так і пригнічення біоплівкоутворення.

     Таким чином, вивчення впливу різних факторів середовища на формування біоплівки є актуальною проблемою, так як незважаючи на активне дослідження механізмів стійкості бактерій біоплівки, це питання залишається відкритим.

 

Література:

1.       Адрианов Н.В. Биологическое действие ультрафиолетового излучения. «Электронная медицина» 2007. – С. 255 – 301

2.       Афиногенова А. Г. Микробные биопленки РАН: состояние вопроса / А. Г. Афиногенова,Е. Н. Даровская // Травматология и ортопедия России. – 2011. – № 3. – С. 119–125.

3. Белобородова Н.В., Байрамов И. Т. Микробные биопленки/ Белобородова Н.В., Байрамов И. Т.// НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, г. Москва, Россия

4. Гостев В. В. Бактериальные биопленки и инфекции / В. В. Гостев, С. В. Сидоренко // Журнал инфектологии. – 2010. – Т. 2, № 3. – С. 4–15.    

5.       Пронина Е.А., Швиденко И.Г., Шуб Г.М. Формирование бактериальных биопленок под воздействием электромагнитного излучения. Научный журнал  «Фундаментальные исследования» 2010, № 10 - стр. 40 – 45

6.       Сидоренко С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека // Инфекции в хирургии. 2004. Т. 2. № 3. С. 16-20.

7.       Смирнова Т. А., Диденко Л. В., Азизбекян Р. Р., Романова Ю. М., Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок, Микробиология, 79(4), 2010, С. 435—446

8.       Тец В.В. Бактериальные сообщества. // Клеточные сообщества / под ред. В.Теца. СПб.: Изд-во СПб ГМУ,1998.С. 15-73.

9.       Beveridge T.J. Visuаlizing bacterial cell walls and biofilms //Microbe. 2006. – V. 1. – № 6. – P. 1–6.

10.     Biofilms, Infection, and Antimicrobial Therapy / ed. J.L. Pace, [et. al.]. – Boca Raton: Taylor & Francis Group. – 2006. – 495 p.

11.     Cirioni O. RNAIII-Inhibiting Peptide Significantly Reduces Bacterial Load and Enhances the Effect of Antibiotics in the Treatment of Central Venous Catheter–Associated Staphylococcus aureus Infections / O. Cirioni, [et. al.] // J. of Inf. Dis. – 2006. – №193. – P. 180–186.

12. Wolfson J.S., Hooper D.C., McHugh G.L., Bozza M.A., Swartz M.N. Mutants   of Escherichia coli K12 exhibiting reduced killing by both quinolone and beta_lactam antimicrobial agents // Antimicrob. Agents Chemother. 1990.V. 34. P. 1938–1943.