Биологические науки/5. Молекулярная биология

Белик В.П., к.м.н. Кудаева И.В., к.б.н. Маснавиева Л.Б.

Ангарский филиал УРАМН ВСНЦ экологии человека СО РАМН –

НИИ медицины труда и экологии человека

Анализ эффективности методов пробоподготовки ДНК, предлагаемых Российскими производителями

Учитывая возросший интерес врачей различных специальностей к изучению полиморфизма генов и необходимость максимального упрощения процедур проведения высокорезультативных исследований, целью данной работы явился подбор наиболее адекватного способа проведения пробоподготовки ДНК с помощью коммерческих наборов, имеющихся на Российском рынке лабораторных реактивов, для возможности дальнейшего их использования при работе с образцами крови, подвергавшимися заморозке.

Материалы и методы.

Забор крови производился с использованием вакуумной системы забора крови, содержащей в качестве антикоагулянта К3-ЭДТА. Полученную таким образом цельную кровь аликвотировали в микропробирки по 0,5мл и хранили при -70ºС. Выделение ДНК проводили при помощи отечественных тест-систем: усовершенствованного метода на основе набора «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», Россия) и хорошо зарекомендовавших себя сорбционных (сорбентных) наборов: «ДНК-сорб В» (АмплиCенс®, Россия) и «Пробоподготовка универсальная» (ООО «Компания Биоком», Россия). Исследования проводили на замороженных образцах крови одних и тех же индивидуумов. Сравнение результатов выделения ДНК проводили при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для ее постановки использовали наборы по определению полиморфизма гена аполипопротеина АРО С3 и гена АРО Е (ООО «Центр молекулярной диагностики»).

Результаты и обсуждение.

В процессе решения поставленной задачи было решено адаптировать комплект реактивов по выделению ДНК «ДНК-экспресс», являющегося наименее трудо- и временезатратным, для работы с образцами замороженной крови. В инструкции этого набора содержатся указания о том, что данные реактивы используются для выделения ДНК из лейкоцитов свежей крови. В нашем случае этап выделения лейкоцитов на градиенте плотности не производился. Для очистки ДНК-содержащих клеток крови от эритроцитов (а вернее, от гемоглобина, являющего ингибитором ПЦР) решено было использовать специализированный буфер для их лизиса – RCLB с последующей отмывкой деионизированной водой. Дальнейшее выделение ДНК проводилось по инструкции производителя набора «ДНК-экспресс». Отмывку лейкоцитов проводили с помощью лизирующего буфера RCLB (0,32М сахароза; 10мМ Трис-HCl pH7,5; 5мМ MgCl2; 1% Тритон Х-100) и деионизированной воды следующим образом. В пробирку типа Эппендорф объемом 1,5мл с предварительно размороженной кровью в количестве 0,5мл добавляли 1мл лизирующего буфера и тщательно перемешивали с использованием вортекса. Далее пробу центрифугировали при 13000об/мин в течение 20сек; супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 1мл деионизированной воды. Далее пробу вновь подвергали центрифугированию при 13000об/мин в течение 20сек; супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 200мл готового реагента из набора «ДНК-экспресс». На следующем этапе пробу перемешивали при помощи вортекса 10сек. Далее пробирку помещали в разогретый до +98ºС термостат и инкубировали в течение 10 - 15мин. После этого пробу центрифугировали при 13000об/мин 15сек. Подготовленная таким образом надосадочная жидкость содержала выделенную ДНК и готова к использованию в ПЦР. Выше описанный способ выделения ДНК содержит 12 этапов, что важно для оценки производительности методики, при этом пробирка с образцом подвергалась открыванию 5 раз.

Выделение ДНК при помощи набора «ДНК-сорб В» производилось согласно прилагаемой производителем инструкции. Данный способ содержит 30 различных этапов, в процессе выполнения которых пробирки с пробами открывались 11 раз. В качестве образцов для этого метода использовали 100мкл замороженной крови, в которую добавляли 300мкл лизирующего буфера и тщательно перемешивали на вортексе, после чего пробы инкубировали в течение 5мин при +65ºС. По окончании инкубации пробирки подвергали центрифугированию при 5000 - 13000об/мин. Полученный таким образом супернатант смешивали дважды с интервалом в 2 мин с 25мкл сорбента при помощи вортекса. Через 5 мин после этого пробы центрифугировали при 5000об/мин в течение 5мин. Супернатант отбрасывали, а осадок промывали в 300мкл раствора для отмывки №1 последовательным встряхиванием на вортексе и осаждением при 5000об/мин в течение 30сек. Полученную надосадочную жидкость вновь отбрасывали, а осадок растворяли и дважды промывали в 500мкл раствора для отмывки №2 аналогично процедуре предыдущего этапа. Исключением являлась скорость центрифугирования: 10000об/мин. После окончания отмывки, супернатант удаляли, а осадок высушивали при +65ºС в течение 10мин, после чего растворяли в 50мкл ТЕ-буфера, перемешивали и прогревали при +65ºС в течение 5 мин, периодически подвергая встряхиванию на вортексе. На заключительном этапе пробы центрифугировали при 12000об/мин одну минуту. Полученый супернатант переносили в чистую пробирку.

Получение ДНК из образцов крови при помощи набора «Пробоподготовка универсальная», также представляющего собой сорбционный метод, включало такое же количество стадий, при этом общее число открываний эппендорфов с содержимым составило 12 раз. Следует учитывать, что процесс открывания пробирок в процессе выделения ДНК представляет собой риск контаминации образцов.

Для выделения ДНК при помощи указанного набора брали 100мкл замороженной крови, которую смешивали с 300мкл лизирующего буфера и перемешивали, переворачивая пробирку. На следующем этапе пробу прогревали при +65ºС в течение 20мин и центрифугировали при 5000об/мин в течение 10сек. Полученный супернатант переносили в подготовленную пробирку с сорбентом, перемешивали на вортексе и инкубировали при комнатной температуре 7мин, периодически встряхивая. После последующего центрифугирования пробы в течение 10сек при 10000об/мин супернатант отбрасывали, а осадок промывали в 200мкл лизирующего реагента. Далее в пробу вносили 800мкл солевого буфера и тщательно перемешивали, затем центрифугировали при 2000об/мин в течение 20сек. Полученную таким образом надосадочную жидкость аккуратно удаляли, а к осадку добавляли 1мл солевого буфера, и тщательно смешивали их на вортексе в течение 10сек, после чего пробы центрифугировали 20сек при 10000об/мин. Данный этап промывки солевым буфером повторяли дважды, после чего надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок высушивали при +65ºС на протяжение 5мин. На следующем этапе осадок растворяли в 50мкл ЭкстраГена, перемешивали на вортексе 10сек и прогревали при +65ºС в течение 5 - 7мин. После этого содержимое пробирки еще раз кратковременно ресуспендировали при помощи вортекса и центрифугировали 1мин при 10000об/мин. Полученный супернатант переносили в чистую пробирку.

Приготовление рабочей смеси и проведение ПЦР проводили согласно инструкций к наборам. Исключение составил объем вносимой пробы, который был увеличен с 2мкл, предлагаемых производителем, до 5мкл. Данное изменение осуществлялось за счет уменьшения вносимой в рабочую смесь воды. При изучении полиморфизма гена АРО С3 в процессе амплификации образовывался фрагмент размером 140 пар оснований. В случае исследования гена АРО Е синтезировался фрагмент в 213 пар нуклеотидов. Для определения аллелей полученные участки ДНК подвергали эндонуклеазной рестрикции. Результаты анализировали после электрофореза в 7% полиакриламидном геле.

Образцы ДНК, выделенные из одной пробы тремя разными способами, были амплифицированы для накопления фрагментов двух полиморфных генов АРО С3 и АРО Е. Полученные продукты размещали в соседние лунки геля. После часа разгонки и окрашивания бромистым этидием результаты электрофореза документировали на цифровых фотоснимках.

В результате проведенного эксперимента было определено, что наиболее слабым свечением обладал продукт амплификации, полученный после обработки образцов крови набором «ДНК-экспресс». Наиболее окрашенным оказался продукт, полученный после выделения ДНК набором «Пробоподготовка универсальная». Амплификат, синтезированный после выделения ДНК набором «ДНК-сорб В», имел промежуточную степень окрашенности. Следует учитывать, что на интенсивность свечения ДНК в геле может влиять как степень ее очистки, так и объем выделенной из образцов ДНК, определяющие конечный объем амплификата. Кроме того, было выяснено, что использованные нами сорбционные методы явились сопоставимыми как по способности очистки ДНК от ингибиторов, так и по объему выделенной при помощи них ДНК. «ДНК-экспресс» метод выделения уступил им по степени очистки от ингибиторов. Итоги, характеризующие общее количество этапов, число открывания пробирок с пробой при проведении пробоподготовки разными методами, а также качество полимеразной цепной реакции, проведенной с полученной этими способами ДНК, представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Сравнительная характеристика применения наборов для выделения ДНК

Методика выделения	Принцип	Число этапов	Количество открытия пробирок	Результат ПЦР
«ДНК-экспресс»		12	5	++
«ДНК-сорб В»	Сорбционный	30	11	++++
«Пробоподготовка универсальная»	Сорбционный	30	12	+++

Подобный итог эксперимента можно было предположить заранее вследствие того, что сорбционные методы позволяют отделить ДНК, прежде всего, от ингибиторов ПЦР, в то время как реагент «ДНК-экпресс» осуществляет только инактивацию ингибиторов ПЦР в пробе. Тем не менее, следует учитывать, что в этом случае выделение ДНК проводилось из 500мкл крови, в результате чего было получено примерно 150мкл анализируемого образца нуклеиновой кислоты (отношение кровь : образец ДНК - 3,33 : 1). Для сорбционных способов выделения брали 100мкл крови, конечный продукт пробоподготовки был растворен в 50мкл буфера. В этом случае было получено примерно 30мкл раствора ДНК (отношение кровь : образец ДНК - 3,33 : 1). Представленные результаты свидетельствуют, что после выделения ДНК разными методами в ПЦР во всех случаях было взято количество ДНК, одинаково пропорциональное объему взятой в эксперимент крови.

Заключение. В целом можно сказать, что апробация набора «ДНК-экспресс» с образцами замороженной крови, характеризующимися большим количеством нуклеиновых кислот показала приемлемый результат амплификации с последующей рестрикцией при исследовании полиморфизма генов. Его можно рекомендовать в качестве метода выбора для выделения ДНК при проведении массовых исследований SNP из образцов замороженной цельной кров.

Литература

1. Кольман Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рем, М.: Мир, 2000. – 469с.

2. Мушкамбаров Н.Н. Молекулярная биология. / Н.Н. Мушкамбаров, С.Л. Кузнецов М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. – 544с.

3. ПЦР «в реальном времени» / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимиов и др.; под ред. Д.В. Ребрикова. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. – 215с.