Биологические науки/ 6. Микробиология

к.х.н. Таутова Е.Н., к.х.н. Хамитова А.С., Николаева М.И.

Кокшетауский государственный университет им. Ш. Уалиханова, Казахстан

Изучение условий культивирования почвенных грибов – продуцентов ценных антибиотиков

Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности некоторых видов грибов, которые задерживают или полностью подавляют рост других видов микроорганизмов. В настоящее время известна значительная группа микроорганизмов, принадлежащих к грибам, метаболитами которых являются разнообразные антибиотические вещества, некоторые из которых достаточно хорошо изучены и имеют большое практическое значение в различных направлениях медицины и в некоторых сферах народного хозяйства.

Основная же часть грибных антибиотиков мало изучена и поэтому не нашла еще практического применения. Кроме того, некоторые продукты метаболизма определенных групп грибов обладают высокой токсичностью, но при этом эти микроорганизмы, как объекты изучения, не следует сбрасывать со счета, так как они вполне могут оказаться перспективными в плане научного исследования для получения жизненно важных для человека соединений.

Целью работы является изучение условий культивирования грибов родов Penicillium и Aspergillus. Объекты данного исследования: почвенные микроорганизмы родов Aspergillus и Penicillium, являющихся продуцентами некоторых ценных антибиотиков: пенициллин, фумагиллин, гризеофульвин, нашедших применение в Медицинской и сельскохозяйственной практике.

Пенициллины (Penicillin).

Пенициллины могут вырабатывать многие виды Penicillium, а также некоторые виды Aspergillus. Обычно при производстве антибиотика используют эффективные штаммы P. chrysogenum. В настоящее время  в промышленных условиях получают культуральные жидкости с содержанием пенициллина более 50 тыс. ед./мл.

Условия культивирования. В качестве единственного источника углерода среды лучшим соединением для биосинтеза пенициллина признана лактоза, т. к. она утилизируется грибом медленнее, чем, например, глюкоза, в результате чего в период максимального образования антибиотика лактоза еще содержится в среде. Лактозу можно заменить легко усваиваемыми углеводами (глюкозой, сахарозой, галактозой, ксилозой) при условии их непрерывного введения в среду. При непрерывном введении в среду глюкозы (0,032 масс. % / ч) выход пенициллина на кукурузной среде повышается по сравнению с использованием лактозы на 15 %, а на синтетической среде — на 65 %. Некоторые органические соединения (этанол, ненасыщенные жирные кислоты, молочная и лимонная кислоты) усиливают биосинтез пенициллина. Важную роль в процессе биосинтеза играет сера. Продуценты антибиотика в качестве серы хорошо используют сульфаты и тиосульфаты. В качестве источников фосфора P. chrysogenum может использовать как фосфаты, так и фитаты (соли инозитфосфорных кислот).

Большое значение для образования пенициллина имеет аэрация культуры; максимальное его накопление происходит при интенсивности аэрации, близкой к единице. Уменьшение интенсивности аэрации или ее чрезмерное увеличение снижает выход антибиотика. Повышение интенсивности перемешивания также способствует ускорению биосинтеза.

Фумагиллин (Fumagillin)

Фумагиллин (фугиллин, фумидил, фагопедин) относится к группе полиеновых соединений,  в его составе имеются четыре сопряженные двойные связи. Фумагиллин (С₂₆H₃₄O₇, T_плав 189–194 °С,  –26,6° (0,25 % в MeOH)) кристаллизуется в виде бесцветных призм из водного метанола, он не растворим в воде, растворим в большинстве органических растворителей, кроме насыщенных углеводородов, образуется культурой Aspergillus fumigatus.

Условия культивирования. При культивировании продуцента на среде, содержащей кукурузный экстракт и крахмал, в условиях аэрации образуется до 100 ед./мл фумагиллина. Антибиотик выделяют из культуральной жидкости экстракцией хлороформом или бутилацетатом с последующей очисткой кристаллизацией из соответствующих растворителей. Разработан способ выделения антибиотика путем осаждения его кислотой с последующей перекристаллизацией из органического растворителя.

Гризеофульвин (Griseofulvin)

Гризеофульвин (7-хлор-2',4,6-триметокси-6'-метил-2'-гризен-3,4' -дион; грицин, гризовин, фульвицин, фульцин, грифульвин) относится к группе кислородсодержащих гетероциклических соединений, имеющих  в качестве заместителя атом хлора. Гризеофульвин {C₁₇H₁₇O₆Cl, T_плав 218–219 °С (разл.),  +337 (1 % в ацетоне) [148]} умеренно растворим в хлороформе, бензоле, ацетоне, этилацетате и не растворим в воде. В УФ-спектре гризеофульвина имеются максимумы поглощения при 236, 252, 291 и 324 нм.

Условия культивирования. Антибиотик образуют плесневые грибы из рода Penicillium (P. griseofulvum, P. nigricans, P. raistrichi и др.). Гризеофульвин получают при развитии гриба P. griseofulvum (синоним P. patulum) в глубинных условиях культивирования в среде, содержащей кукурузный экстракт, лактозу, KН₂РО₄ и KCl. Стимуляция образования антибиотика наблюдается при добавлении к среде тартрата аммония. В некоторых странах для получения гризеофульвина используется P. nigricans, который  в процессе развития не образует весьма токсичного патулина. При биосинтезе гризеофульвин накапливается в мицелии и растворе, откуда выделяется экстракцией растворителем, например CH₂Cl₂. Экстракт упаривают, остаток экстрагируют горячим бензолом, а затем перекристаллизовывают из этанола.

В данной работе для исследования использовались питательные среды четырех видов: среда Чапека, голодный агар, крахмально – аммичная среда и среда Эшби. Самыми продуктивными из них оказались среда Чапека и крахмально – аммиачная. На среде Чапека колонии всех чашек Петри очень разнообразны по виду, численности, размерам. Колонии Asp. и Pen. тесно сожительствуют. Также присутствуют колонии актиномицет и различных бактерий. Aspergillus растет отдельными колониями, размеры которых в среднем составляют около 20 – 30мм (в диаметре). Колонии правильной округлой формы. Имеют очень «богатую» спороносящую часть. Колонии Penicillium более мелких размеров, чем колонии Aspergillus, имеют неправильную разнообразную форму (овальную, более вытянутую, с выростами). Колонии имеют различную окраску (от бледно-желтой до насыщенной оранжевой). По подсчетам и наблюдениям на данной среде лучше всего росли и размножались грибы образцов почвы «сосновый лес» и взятой вблизи «муравейника», возможно это объясняется тем, что именно в этих образцах присутствует наибольшее процентное содержание макро- и микроэлементов и отсутствие высокого процента физической глины.

На крахмально – аммиачной среде микроорганизмы растут практически одной сплошной колонией в отличие от среды Чапека. В основном это колонии Penicillium, имеющие стерильный мицелий серого цвета, реже белого. У некоторых колоний наблюдается спороносящая часть изумрудного цвета и выделение экссудата в питательную среду розового, бурого и бордового цветов.

Редко встречаются одиночные колонии Aspergillus очень мелких размеров (до 2 – 3 мм в диаметре), имеющие очень «бедную» спороносящую часть, но выделяющие ярко – желтый экссудат в питательную среду. На всех чашках Петри видимых отличий по численности колоний не наблюдается. Исходя из наблюдений можно сделать вывод, что данная среда подходит для культивирования грибов рода Penicillium, а для Aspergillus нет.

На средах: голодный агар и Эшби, в отличие от двух предыдущих, рост колоний грибов практически не наблюдалось. Исходя из этого можно сделать вывод, что данные среды не подходят для культивирования исследуемых микроорганизмов.

Таким образом, в зависимости от типа почвы, географического положения, состава фаз растительности, а также от типа и состава питательной среды, условий культивирования и многих других факторов соответственно изменяется число видов грибов и активность образования ими антибиотиков в почве, в питательных средах.

Возникновение способности антибиотикообразования и роли образуемых антибиотиков в биологии видов – продуцентов – в естественных и искусственно созданных условиях обусловлено многими факторами и биологическими особенностями грибов-продуцентов. С другой стороны, большая пластичность грибов и изменчивость процессов их метаболизма в зависимости от условий культивирования позволяет направленно регулировать биосинтез определенных антибиотиков, которые нередко в природных условиях не образуются.

Литература:

1. Алмагамбетов К.Х. Биотехнология микроорганизмов. Астана, 2008. – 244 с.

2. Кириленко Т.С. Определитель почвенных сумчатых грибов. Киев, 1978.

3. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л.:Наука, 1967.

4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.:Высшая школа, 1986. 448 с.

5. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Под ред. Д.Г. Звягинцева. – М.: Изд-во МГУ, 1991. – 304 с.