Биричевская Л.Л.¹, Хайкина Д.Б.³, Квач С.В.¹, Ерошевская Л.А.¹,

Кисель М.А.², Николаевич В.А.², Зинченко А.И.¹

¹Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь

²Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

³Международный государственный экологический университет

им. А.Д. Сахарова, Минск

Синтез 5' фосфатидилрибавирина с использованием микробной фосфолипазы D

Противовирусные и противоопухолевые препараты на основе модифицированных нуклеозидов имеют ряд недостатков. Прежде всего, в некоторых клетках-мишенях отсутствуют киназы, способные инициировать метаболическую активацию таких нуклеозидов. Далее, многие нуклеозиды плохо проникают в клетки и поэтому большая часть их выводится из организма в неизмененном виде. Отсюда, поиск препаратов, способных с большей эффективностью проходить сквозь клеточную мембрану, является актуальной задачей. Одним из простых и эффективных подходов к решению проблемы транспорта водорастворимых субстанций через гидрофобные липидные биологические мембраны в клетку является химическая модификация нуклеозидов остатками жирных кислот или фосфолипидами [1–4].

Такие коньюгаты содержат фосфатидный остаток в качестве нетоксичной транспортной группы, которая защищает нуклеозид от разложения ферментами и, обладая высокой аффинностью к клеточным мембранам, облегчает проникновение лекарства в пораженные клетки. В клетках происходит постепенное освобождение нуклеозида, причем в ряде случаев уже в 5′-монофосфорилированной форме, что укорачивает цепь трансформации нуклеозида в истинное действующее начало – нуклеозид-5′-трифосфат. Последнее обстоятельство имеет решающее значение для тех систем, где отсутствует соответствующая нуклеозидкиназа.

Нам представлялось целесообразным для получения фосфолипидных аналогов нуклеозидов использовать не трудоемкие многостадийные химические способы, а предложенный японскими исследователями ферментативный подход, который заключается в переносе фосфатидного остатка с лецитина на первичные спирты под действием микробной фосфолипазы D [5–7] (рисунок 1).

Рисунок 1. – Реакция трансфосфатидилирования нуклеозидов, катализируемая фосфолипазой D

R′, R′′ – алкилы; Х – остаток нуклеозида; Y – остаток холина

С этой целью, ранее нами был отобран штамм Streptomyces netropsis БИМ В-235, продуцирующий внеклеточную фосфолипазу D, и продемонстрирована принципиальная возможность переноса с его помощью фосфатидного остатка с яичного лецитина на рибавирин (1-ß-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) [8]. Настоящая работа является продолжением этого исследования и посвящена препаративному синтезу 5′-фосфатидильного производного рибавирина (рисунок 2) с помощью фосфолипазы D нового, более активного продуцента этого фермента [9].

Рисунок 2 – Структурная формула 5′-фосфатидилрибавирина

Культивирование Streptomyces netropsis БИМ В-428Д (далее S. netropsis), хранящегося в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси, и получение препарата фосфолипазы D проводили, как описано нами ранее [10]. Трансферазную активность фосфолипазы D определяли в реакции переноса фосфатидного остатка с молекулы фосфатидилхолина (лецитина) на 5′-гидроксильную группу тимидина путем инкубирования при 37^оС в течение 45 мин реакционной смеси (1 мл), состоящей из 67% хлороформа и 33% водной фазы и содержащей 10 мМ тимидин, 30 мМ лецитин, 0,1 М Na-ацетатный буфер (рН 6,0), 0,25 М CaCl₂ и 0,2 мл препарата, содержащего фермент. За ходом реакции следили, используя тонкослойную хроматографию (ТСХ) на пластинах Silufol-UV₂₅₄ («Serva», Германия) в системе растворителей хлороформ–метанол–25%-ный аммиак (14:4:0,15; v/v). Вещества обнаруживали в УФ-свете и элюировали: нуклеозид дистиллированной водой, а фосфолипидное производное – этанолом.

Активность фосфолипазы D определяли за время, при котором выход продуктов не превышал 15–20%. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое обеспечивало трансформацию субстрата или образование продукта в количестве 1 нмоль за 1 мин протекания реакции.

Использованный в работе рибавирин синтезировали методом ферментативного трансгликозилирования, как было описано нами ранее [11]. Спектры поглощения записывали на регистрирующем спектрофотометре UV-1202 фирмы «Shimadzu» (Япония).

Проведенные эксперименты по оптимизации условий реакции трансфосфатидилирования позволили предложить следующую методику препаративного получения 5´-фосфатидил-1-ß-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида.

Реакционную смесь (60 мл), содержащую 878 мг (3,6 ммоль) рибавирина, 40 мл хлороформа, 7,9 мл 0,5 М Na-ацетатного буфера (рН 6,0), 960 мг (1,2 ммоль) фосфатидилхолина (соевый лецитин Epicuron-200 фирмы Lucas Meyer; Германия), 1 мл 2,0 М CaCl₂ и 11 мл фильтрата КЖ (содержащего 1,5 тыс. ед./мл фосфолипазы D), перемешивали при 37^оС в течение 3 ч. Затем к реакционной смеси добавляли 20 мл насыщенного раствора NaCl и 40 мл метанола, слои разделяли центрифугированием (3000 g, 5 мин), отбирали нижний хлороформно-метанольный слой, и растворитель упаривали под вакуумом. Остаток растворяли в 15 мл хлороформа и очищали флеш-хроматографией на силикагеле (размер частиц 5–40 мкм), применяя ступенчатый градиент растворителей хлороформ-метанол от 19:1 до 2:1 (по объему). Фракции, содержащие по данным ТСХ чистый 5´-фосфатидилрибавирин, собирали и растворитель упаривали. Выход целевого продукта 290 мг (30%). Структура целевого продукта доказана на основании анализа данных ТСХ, УФ- и ¹Н-ЯМР-спетроскопии.

Таким образом, в настоящей работе экспериментально обоснована возможность использования препарата фосфолипазы D нового штамма-продуцента S. netropsis БИМ В-428Д для препаративного синтеза коньюгата фосфолипида с противовирусным нуклеозидом – рибавирином. Имеются основания полагать, что такая депонированная форма рибавирина будет способствовать его стабильности в русле крови и повышению адресности доставки в клетки-мишени.

Литература:

1. Ryu E.K., Ross R.J., Matsushita T., MacCoss M., Hong C.I., West C.R. Phospholipid-nucleoside conjugates. 3. Syntheses and preliminary biological evaluation of 1-b-D-arabinofuranosylcytosine 5′-monophosphate-L-1,2-dipalmitin and selected 1-b-D-arabinofuranosylcytosine 5′-diphosphate-L-1,2-diacylglycerols // J. Med. Chem. – 1982. – Vol. 25, N 11. – P. 1322–1329.

2. Водовозова Е.Л., Павлова Ю.Б., Полушкина М.А., Ржанинова А.А., Гараев М.М., Молотковский Ю.Л. Новые фосфолипиды – ингиторы репродукции вируса иммунодефицита человека. Синтез и антивирусная активность // Биоорг. хим. – 1996. – Т. 22, № 6. – С. 451–457.

3. Малекин С.И., Кругляк Ю.Л., Хромова Н.Ю. и др. Новые конъюгаты нуклеозидов с фосфолипидами. Синтез и анти-ВИЧ-активность rac-1-гексадецил-2-ацил-sn-глицеро-3-фосфонуклеозидов // Биорг. хим. – 1997. – Т. 23, № 8. – С. 648–654.

4. Швец В.И., Каплун А.П., Юркевич А.М. Создание нового поколения лекарственных и биохимических препаратов, использующих пассивный и активный мембранный и липосомальный транспорт // Тез. докл. XVI Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. – Санкт-Петербург, 1998. – С. 166–167.

5. Shuto S., Ueda S., Immamura S., Fukukawa K., Matsuda A., Ueda T. A facile one-step synthesis of 5′-phosphatidylnucleosides by an enzymatic two-phase reaction // Tetradron Lett. – 1987. – Vol. 28, N 2. – P. 199–202.

6. Shuto S., Imamura S., Fukukawa K., Ueda T. Phospholipase D-catalyzed trans-alkylphosphorylation: a facile one-step synthesis of nucleoside 5′-alkylphospfates // Chem. Pharm. Bull. – 1988. – Vol. 36, N 12. – P. 5020–5023.

7. Shuto S., Itoh H., Sakai A., Imamura S., Matsuda A. Nucleosides and nucleotides. CXXXVII. Antitumor phospholipids with 5-fluorouridine as a cytotoxic polarhead: synthesis of 5′-phosphatidyl-5-fluorouridines by phospholipase D-catalyzed transphosphatidylation // Bioorg. Med. Chem. – 1995. – Vol. 3, N 3. – P. 235–243.

8. Биричевская Л.Л., Ерошевская Л.А., Кисель М.А., Зинченко А.И. Использование фосфолипазы D нового микробного штамма-продуцента для синтеза фосфолипидных производных модифицированных нуклеозидов // Доклады НАН Беларуси. – 2006. – Т. 50, № 4. – С. 68–71.

9. Штамм бактерий Streptomyces netropsis, продуцирующий фосфолипазу D: пат. 11915 Респ. Беларусь, МПК7 С 12N 1/20 / Л.Л. Биричевская, Л.А. Ерошевская, А.И. Зинченко. № а 20071025; заявл. 15.08.07; опубл. 30.04.09.

10. Барай В.Н., Фещенко Л.Л., Демчук Е.И., Зинченко А.И. Разработка метода очистки фосфолипазы D Streptomyces netropsis // Микробиология и биотехнология ХХI столетия: матер. Международ. конф. – Мн., 2002.– С. 169–170.

11. Barai V.N., Zinchenko A.I., Eroshevskaya L.A., Kalinichenko E.N., Kulak T.I., Mikhailopulo I.A. An universal biocatalyst for the preparation of base- and sugar-modified nucleosides via an enzymatic transglycosylation / // Helvetica Chim. Acta. – 2002. – Vol. 85, N 7. – Р. 1901–1908.