О результативности переноса размороженных бластоцист в протоколах медленной заморозки и витрификации.

Яхярова М.П

Институт Репродуктивной Медицины, Центр "ЭКО", г.Алматы (Казахстан)

Резюме

В статье представлены результаты применения протокола медленной заморозки бластоцист и витрификации (быстрая заморозка), с января по декабрь 2013г. Полученные в результате исследования данные свидетельствуют о ряде преимуществ использования метода витрификации.

Ключевые слова Витрификация, Медленная заморозка, Криоконсервация, Бластоцисты

Введение и актуальность исследований

Практический опыт применения медленной заморозки, развитие которого берет начало с 1977 года, обеспечил его статус как наиболее массового метода ВРТ в мировой практике ЭКО [1, 2, 3]. Большая клиническая практика и длительный период развития методики обеспечил высокий технологический уровень, проявленного в различных аппаратно-фармокологических и инструментально-регламентных отраслевых продуктах. Однако, при этом принциальная проблема медленной заморозки как высокая дегидратация клетки сохранила значимость в оптимизации и улучшении своего решения [4]. С высокой долей вероятности это может быть основным фактором в относительно низкой результативности последующего выживания эмбрионов, которая в исключительных случаях превышала 70%, а в среднем, составляла порядка 33%-35% по отрасли в целом.

Наибольший вклад в теоретическое обоснование метода витрификации был внесен английским ученым К. Полге из Кэмбриджа [5]. С первой апробации в 1985 году, реализаванного группой американских ученых во главе с В.Раллом, метод витрификации показал позитивную результативность по выживаемости клеточного материала[6]. В силу ряда факторов исследования по методу были прерваны. Возобновившийся с 1993 года Каваямой работы по развитию метода в 10-летний период привели к практическому преценденту успешной беременности [7;8]. С данного периода метод витрификации вошел в число практических клинических технологий, с высокой динамикой годового роста. Основной проблемой витрификации является воздействие сложных криопротекторов на структуру живой клетки в процессах замороживания и последующей разморозки. При этом объективным преимуществом метода выступают высокая степень виживаемости эмбрионов, превышающим в среднем 90%, и отсутствие гормональной стимуляции cуперовуляции пациента [9].

Наличие альтернативных методик в переносе эмбрионов , в формах протокола медленной заморозки и витрификации, обуславливает острую необходимость анализа и оценки их результативности в условиях реальной клинической деятельности. В данном аспекте, настоящая работа является одной из числа пионерских исследований посвященной анализу эффективности приведенных методов в казахстанской клинической практике ЭКО.

Цель исследований

Криоконсервация и перенос размороженных эмбрионов на сегодня является системной единицей сферы массовой клинической практики в деятельности Института Репродуктивной Медицины (ИРМ). При этом, в клинической практике ИРМ задействованы распространненые методики «медленной заморозки» и витрификации. С большой вероятностью можно прогнозировать позитивную динамику роста в ближайщей перспективе в составе медицинских услуг ИРМ использование технологии криоконсервации как в «протоколе медленней заморозки», так и в методе витрификации. В связи с этим, основной целью настоящих исследований является критический анализ и оценка сравнительной эффективности метода «медленной заморозки» и витрификации в условиях реальной клинической и методического обеспечения роста результативности ЭКО для пациентов ИРМ. При этом, особое внимание было обращено вопросам детализации особенностей процесса криоконсервации, переноса размороженных эмбрионов и определение эффективности криопротоколов в программах ВРТ по следующим параметрам: выживаемость эмбрионов, частота клинических беременностей на перенос, частота имплантации

Материалы и методы

Эмбрионы, оставшиеся после переноса и достигшие стадии бластоцисты, подвергались замораживанию. Данное производилось и для случая отмены переноса из-за развившегося синдрома гиперстимуляции яичников

Исследованию подвергались результаты переноса размороженных бластоцист в период с января 2013 по декабрь 2013г. Общее число циклов переноса криоконсервированных бластоцид составило 710 единиц по всему периоду. При этом, структура данной выборки переносов имела вид: 504 циклов были представлены в медленных протоколах, а 206 циклов - по методу витрификации. Вся выборка переносов сосредоточена в рамках деятельности Центра ЭКО ИРМ (г.Алматы).

Замораживание и размораживание эмбрионов по медленному протоколу проводилось в соответствии с протоколом, разработанным в 1996 году группой под руководством J. Tastert с применением 1,2 – пропандиола и сахарозы [10]. Для криоконсервации и оттаивания бластоцист применялся протокол "двух шагов" [11]. В качестве среды использовался фармоколический продукт компании «Medicult» (Дания). Для криоконсервации применялся программный замораживатель «Freeze control CL-8000 Cryologic»

Витрификация и оттаивание бластоцист были выполнены по технологии открытой витрификации в жидком азоте методами Cryotop и Cryotech [7;8]. При этом, перед криоконсервацией независимо от метода, экспандированные и вылупляющиеся бластоцисты подвергались вспомогательному коллапсу.

Бластоцисты размораживали и инкубировали в среде культивирования в период 2-4 часа до переноса в полость матки.

Частота выживаемости рассчитывалась как отношение числа интактных эмбрионов к общему числу размороженных эмбрионов.

Блатоциста считалась интактной при сохранении целостности структур внутренней клеточной массы и трофэктодермы.

Результаты

Возраст пациенток в обеих группах был приблизительно одинаков 34,7 в группе с использованием медленного протокола и 34,9 при использование метода витрификации.

Среднее количество эмбрионов на перенос в двух протоколах составил - 1,8

показатель	ед	медленная заморозка	витрификация
Количество циклов	шт	504	206
Выживаемость	%	72,7	89,1
Интактные	%	64	77
Биохимическая беременность	шт	9	2
Клиническая беременность	%	35	42

Обсуждение

Важным фактором для криоконсервации, без негативного влияния на эмбрион, является сохранение целостности мембран клеток. И функциями криопротекторов является ослабление эффекта кристализации и препятствование слипанию и денатурации макромолекул. [12;13;14] Современные наборы сред для криоконсервации методом витрификации содержат оптимальный состав криопротекторов, позволяющие сохранить целостность и интактность эмбриона [13,15]. Также, в качестве объекта последующей детализации выявлен вопрос потенциала выживаемости эмбрионов.

Выводы

• Метод витрификации демонстрирует устоичивый тренд преимущества ряда показателей по сравнению с протоколом медленного замораживания

• Использование метода витрификации позволяет максимально увеличить шансы на наступление беременности после ЭКО, уменьшить или предотвратить гибель нормальных жизнеспособных эмбрионов, оставшихся после цикла ЭКО.

• Актуальным вопросом устоичивого развития метода витрификации является усовершенствование техники повышения выживаемости эмбрионов.

Использованная литература.

1. Edwards RG and Steptoe, PC. The Relevance of the Frozen Storage of Human Embryos. Ciba Foundation Symposi 52. Elsevier. Excerpta Medica. North-Holland. 1977

2. Trounson, A. and Mohr, L. (1983) Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature, 305, 707-709. 1983

3. Zeilmaker GH, Alberda AT, van Gent I, Rijkmans CM, Drogendijk AC. Two pregnancies following transfer of intact freezing-thawed embryos. Fertility and Sterility 42^ 293-296, 1984

4. Гордиенко Е.А., Иткин Ю.А., Ишков Г.С. Кинетика обезвоживания клеток в многокомпонентных средах при наличии проникающего через мембрану вещества. Механизмы криоповреждений и криозащиты биологических структур, Киев: Наук, думка, 1977.

5. Polge C (1957). "Low-Temperature Storage of Mammalian Spermatozoa". Royal

Society of London 147 (929): 498–508.

6. Rall, WF; Fahy, GM (1985 Feb 14-20). "Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification.". Nature 313 (6003): 573. 

7. Kuwayama M., Vajta G., Kato O., Leibo S.P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod Biomed Online 2005; 11: 3: 300—308.

8. Katayama K., Stehlik J., Kuwayama M. et al. High survival rate of vitrified human oocytes results in clinical pregnancy. Fertil Steril 2003; 223—224.

9. Казарян M. Оптимизация метода ЭКО и ПЭ путем использования программы криоконсервации эмбрионов: автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 2005.

10. Tasters J., Belaisch A.J., Lassale B. Factors influencing the success rate of human embryo freezing in in vitro fertilization and embryo transfer program // Fértil. Steril.- 1987.

11. Kyrou D., Fatemi H.M., Blockeel C. Transfer of cryopreserved thawed embryos in hCG induced natural or clomiphene citrate cycles yields similar live birth rates in normo-ovulatory women // J. Assist. Reprod. Genet. - 2010. - Vol. 27 (12). - P. 683-68957.

12. Corbacioglu A., Baysal B. Effects of endometrial thickness and echogenic pattern on assisted reproductive treatment outcome // Clin. Exp. Obstet. Gynecol. 2009. - Vol. 36 (3). - P. 145-147.36.

13. Developmental prognosis for zygotes based on pronuclear pattern: usefulness of pronuclear scoring / G. Arroyo et al. // J. Assist. Reprod. Genet. 2007. - Vol. 24 (5). - P. 173-181

14. Usadi R.S. Temporal and morfologic characteristics of pinopod expression across the secretory phase of the endometrial cycle in normal cycling women with proven fertility // Fértil. Steril. 2003. - Vol. 79. -P. 970-974.

15. Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O., Shaw J.M. Sugars exert a major influence on the vitrification properties of ethylene glycol-based solutions and have low toxicity to embryos and oocytes. Cryobiology 1999; 38: 2: 119—130.