Биологические науки/Микробиология

д.б.н. Лахтин В.М., к.б.н. Лахтин М.В., Агапова Ю.В., Беликова Ю.В., Кулакова Ю.В. д.м.н. Афанасьев С.С., д.б.н. Алешкин В.А.

Отдел медицинской биотехнологии, Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

Преимущества пробиотического консорциума «Ацилакт» в сравнении с ингредиентными штаммами с использованием алгоритма ранжирования качеств

Резюме

      Предложена алгоритмическая оценка распределения параметров  в системе «Смешанный пробиотик - Ингредиентные штаммы» на примере Ацилакта и его штаммов. Подход продемонстрирован на примере новых высокомолекулярных и низкомолекулярных метаболитов супернатантов культуральных жидкостей. Описаны новые параметры пробиотической системы, установлено дискретное (есть или нет) распределение параметров между штаммами. Дана новая формула Ацилакта с преимущественными свойствами. Указаны штаммы – вкладчики лидирующих свойств в Ацилакт. Результаты свидетельствуют о перспективах новых применений Ацилакта и его штаммов. Предложенный подход перспективен для разработки новых комбинированных расширенных по числу штаммов и видов пробиотиков, прогнозирования нового потенциала применения полимерных и сборочных компонентов пробиотических систем.     

Ключевые слова: пробиотики, лактобациллы, консорциумы, Ацилакт.

Resume

Lakhtin V.M., Lakhtin M.V., Agapova Y.V., Belikova Y.V., Kulakova Y.V., Afanasyev S.S., Alyoshkin V.A. Department of Biotechnology, G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Russia

Advantadges of the probiotic “Acilact” compared to ingredient strains using algorithmic ranges of qualities

      Algorithmic evaluation of distribution of parameters in the system “Mixed probiotic – Ingredient strains” is proposed on the example of Acilact and its strains. The approach was applied to analysis of the new high and low molecular mass metabolites of cultural fluids. New important probiotic parameters are described. Examples of the discrete (“yes or no”) distribution of parameters between strains are given. The resulting new formula of Acilact having maximally expressed parameters is presented. The strains as the main contributors of important properties into Acilact are presented. Results indicate prospects of the new applications of Acilact and its strains. The approach proposed is of value for development of new probiotic extended combinations of strains and species. It allows prediction of new potential of applications of the polymeric and assembled components of the probiotic systems.          

Key words: probiotic, Lactobacillus, consortium, Acilact.

 

      Введение: Лактобациллярный пробиотик-консорциум «Ацилакт» нашел широкое применение в профилактике и лечении болезней, проявил себя эффективным противовоспалительным, антимикробным, антивирусным, иммуномодулирующим средством при лечении человека и испытаниях на обезьянах и других животных [1-9]. Оказалось, что Ацилакт следует рассматривать не как внутривидовой (L. acidophilus), а как внутриродовой пробиотик, включающий штаммы NK1 и 100аш, относящиеся по данным комбинированного молекулярно-генетического анализа к группе L. helveticus, и шт. К3III24, относящийся к группе L. casei/paracasei [10]. В связи с этим актуален поиск возможных новых выраженных различий в постгеномной экспрессии метаболитов составляющих Ацилакт штаммов. Это, прежде всего, относится к 14 известным группам регуляторов кросс-токинга и чувства кворума, из которых 8 -  (поли)пептидной, белковой и аминокислотной природы [11]. Цель – разработать простой сравнительный метод ранжирования качеств комбинированного пробиотика и составляющих его штаммов и применить его для оценки приоритетных наборов функциональных и технологических свойств Ацилакта и его моноштаммовых культур.

      Материалы и методы: Использовали штаммы NK1, 100аш и  К3III24 лактобацилл из коллекции микроорганизмов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Закваски лактобацилл подращивали на обезжиренном молоке и затем выращивали в жидкой среде КД-5 в течение 18-24 ч при 37оС, получали супернатанты и концентраты мембранной микро- и ультрафильтрацией. Белки, ферменты, лектины, высокомолекулярные биосурфактанты и небелковые экзополимеры  оценивали после изоэлектрофокусирования и электрофореза образцов в полиакриламидном геле [5, 12-16]. Разделенные компоненты электроблотировали на гидрофобную иммобилоновую мембрану. Компоненты в геле и на блоте проявляли кумасси R-250, флуоресцентным красителем SYPRO Ruby protein stain или хемилюминесцентным сэндвичем (биотинилированными аналогами полисахаридов и затем – стрептавидин-пероксидазой, проявление пероксидазы хемилюминесцентным субстратом). Использовали также спектрофотометрические методы определения белков и пептидов, стандартный колоночный анализ аминокислотного состава. Биосурфактанты определяли также методом Youssef et al. в нашей модификации [13], остаточное пигментирование препаратов – по оптической плотности при 420 нм (D420). Антибактериальная активность супернатантов и концентратов тестировалась с использованием стандартных штаммов-диагностикумов грамотрицательных и грамположительных бактерий [2, 5, 6].

      Результаты: Провели сравнение 32 параметров Ацилакта и его ингредиентных штаммов (таблица 1). Четырехкодовая запись (справа) легко комбинирует технологические преимущества Ацилакта в сравнении с ингредиентными штаммами:

А. Максимальные параметры для Ацилакта в начале формул 1.3, 1.4, 1.6, 5.7, 5.8, 5.10, 5.13-5.15 и 5.19 в правой части таблицы: Антибактериальная активность, выраженность оксидазо-редуктазной системы (вклад в антиоксидантный потенциал) и казеиназ (потенциал образования антимикробных и гипотензивных пептидов, устранение аллергенности), максимальные скорость ультрафильтрации и степень концентрирования. Кроме того, Ацилакт обладает уникальным расширенным набором лектинов, обладающих антипатогенным действием [17, материалы II-й международной конференция «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской приматологии»].  

Б. Минимальные параметры для Ацилакта в конце формул 1.1, 1.2, 1.5, 4, 5.3, 5.5 и 5.11, переведенные в максимальные: Максимальная утилизация белков (выраженность протеиназ), низкая степень пигментации (обесцвечивание оксидазо-редуктазной системой), минимальное содержание высокомолекулярных флуорофоров, потребление Leu и Val (повышенное содержание ЛЖК), отсутствие агрегации при хранении.

      А и Б формируют единую формулу Ацилакта (А+Б).

      Внутривидовое сходство штаммов NK1 и 100аш  (L. helveticus) и их отличие от штамма К3III24 (L. casei/paracasei) подтверждается характером распределения белков по данным изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле. Кроме того, у К3III24 при подращивании на молоке обнаруживаются катионные легко диффундирующие небелковые компоненты, не выраженные у других штаммов, но присутствующие в Ацилакте [15]. Этот же штамм проявляет заметную антигрибковую активность [5]. В то же время штамм NK1 выступает как главный штаммовый источник лектинов и адгезинов, а его концентрат проявляет способность флоккулировать в условиях инкубации ночь при комнатной температуре. В свою очередь, штамм 100аш отличается как преимущественный донор оксидазо-редуктазной системы. Крайне низкое содержание в супернатанте цистина  указывает на выраженность восстановительных процессов, в том числе  антиоксидантных с участием редуктаз.

      Выводы: Результаты указывают на перспективы: а) дальнейшего исследования и применения Ацилакта и его ингредиентных штаммов, в том числе в приматологии; б) изучения функциональных свойств и роли лектинов, редуктаз, казеиназ, деполимераз, биосурфактантов, компонентов с необычными флуорофорными свойствами, экзополимеров (полисахаридов и других), в том числе ассоциированных с белками; в) антимикробных агентов с повышенной селективностью к эукариотическим патогенам (грибковым и другим); г) алгоритмического подхода для конструирования пробиотиков и использования в других клеточных технологиях.  

Литература:

1. Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Несвижский Ю.В., Поспелова В.В., Лахтин М.В., Воропаева Е.А., Черепанова Ю.В., Агапова Ю.В. Стратегические аспекты конструирования пробиотиков будущего // Вестник РАМН. - 2008. - № 2. - С. 33 - 44.

2. Поспелова В.В., Алешкин В.А., Ульянова Л.П.,  Черепанова Ю.В., Афанасьев С.С., Лахтин В.М., Волкова Е.В., Агеева Л.В. Пробиотик «Ацилакт»: патогенетические механизмы, его лекарственные формы и сферы применения //  Сб. материалов конф. «Современные технологии в диагностике, лечении и профилактике инфекционных болезней у детей». - Москва, MOНИКИ, 2008. - С. 210 - 213.  

3. Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Лахтин М.В., Алешкин В.А., Несвижский Ю.В., Поспелова В.В. Нанотехнологии и перспективы их использования в медицине и биотехнологии // Вестник РАМН. - 2008. - № 4. – 50 - 55.

4. Поспелова В.В., Волохович Т.Т., Черепанова Ю.В., Брюлина Л.М., Ханина Г.И. Лахтин В.М. Пробиотик Ацилакт и перспективы применения при ротавирусной инфекции // Сб. материалов Всерос. научно-практич. конф. «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств и профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – Москва, 2008. -  С. 99.

5. Лахтин В.М., Алешкин В.А., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Лахтин М.В. Антимикробный потенциал высокомолекулярных ассоциатов концентратов  супернатантов Ацилакта и составляющих его штаммов // Сб. материалов 4-й межд. конф. «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - Санкт-Петербург, 2008. - С. 155.

6. Поспелова В.В., Пожалостина Л.В., Черепанова Ю.В., Лахтин В.М., Осипова И.Г., Волкова Е.В.  К механизму лечебной эффективности пробиотика Ацилакт при острых кишечных инфекциях // Сб. материалов 4-й межд. конф. «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - Санкт-Петербург, 2008. - С. 135.

7. Лахтин В.М.,  Лахтин M.В., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В. Потенциал биологических активностей лектинов и других белков пробиотических микроорганизмов для стимулирования цитокинов и иммунокоррекции // Сб. материалов Всерос. научно-практич. конф. «Современные представления об иммунокоррекции». – Пенза, 2008. - С. 70- 72.

8. Поспелова В.В., Ульянова Л.П., Черепанова Ю.В., Волкова Е.В., Лахтин В.М. Влияние пробиотика Ацилакт на факторы иммунного гомеостаза в эксперименте // Там же. – Пенза, 2008. - С. 91 - 93.

9. Поспелова В.В., Черепанова Ю.В., Лахтин В.М., Криворучко Е.В. , Ульянова Л.П., Гвоздик Т.Е., Аршба И.М.  Изучение вариантов пробиотика Ацилакт на живых  моделях // Вестник РУДН. - 2009. - № 1. - С. 5 - 10.

10. Ботина С.Г. Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии // Автореф. дис. д.б.н. - М., 2011. -  46 с.

11. Шендеров Б.А. Молекулярный язык пробиотических микроорганизмов // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2009. - № 1. – С. 47 - 48.

12. Лахтин В.М., Алешкин В.А., Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Черепанова Ю.В., Криворучко Е.В., Поспелова В.В. Блочный анализ белков пробиотических грамположительных бактерий в комбинированных средах // Сб. материалов Всерос. научно-практич. конф. «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств и профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – Москва, 2010. - С. 66.

13. Лахтин В.М., Лахтин М.В., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.. Высокомолекулярные биосурфактанты грамположительных бактерий человека // Клин. лаб. диагностика. – 2010. - № 9. - С. 37 - 38.

14. Лахтин В.М., Лахтин М.В., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Комплексная оценка белка в супернатантах грамположительных бактерий // Клин. лаб. диагностика. – 2010. - № 9. - С. 37.

15. Лахтин М.В., Черепанова  Ю.В., Лахтин В.М., Алешкин А.В., Криворучко Е.В., Агапова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Карты протеома культуральных жидкостей производственных штаммов пробиотических бактерий человека // Сб. материалов научно-практич. школы-конф. мол. уч. и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности». – Оболенск, 2011. – С.
16. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Черепанова  Ю.В., Алешкин А.В., Криворучко Е.В., Агапова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Белковый состав в сочетании с экзополисахаридами культуральных жидкостей бифидобактерий человека // Там же. - Оболенск, 2011. – С.

17. Lakhtin M.V., Alyoshkin V.A., Lakhtin V.M., Afanasyev S.S.,  Pozhalostina L.V., Pospelova V.V. Probiotic lactobacillus and bifidobacterial lectins against Candida albicans and Staphylococcus aureus clinical strains: new class of pathogen biofilm destructors // Probiotics & Antimicro. Prot. – 2010. – V. 2. – P. 186 - 196.

 

Таблица 1. Алгоритмический сравнительный анализ свойств супернатантов                                                   пробиотика «Ацилакт» и его ингредиентных штаммов.

№

 

    Параметры супернатантов лактобацилл,

    особенности параметров, ранжирование

    штаммов и Ацилакта по параметру

Четырехзначная* запись ранжированных штаммов и Ацилакта по параметру

 

1

Содержание частично гидролизованного белка 

K3III24>Ац>100аш>NK1

 

 3        4         2         1

 

1.1

Кислые белки с pI 4-5

NK1>100аш>К3III24>Ац

 

 1         2         3        4        

 

1.2

Щелочные белки с pI 7-8

NK1>K3III24>100аш>Ац

 

 1         3         2        4

 

1.3

Выраженность оксидазо-редуктазной системы

с pI в интервале 5-5.5

Ац>100аш>K3III24>NK1[нет]

 

 

 4         2         3         1

 

1.4

Выраженность казеиназ

Ац>K3III24>100аш>NK1

 

 4         3         2         1

 

1.5

Склонность к агрегации при хранении

концентратов

K3III24>100аш>NK1>Ац[нет]

 

 

3         2         1         4

 

1.6

Способность к ультрафильтрации

Ац>NK1>100аш>K3III24

 

 4         1         2         3

 

2

Высокомолекулярные биосурфактанты

NK1>Ац>>100аш>K3III24

 

 1         4         2         3

2.1

Выраженность биосурфактантов, активных

против минерального масла

K3III24>Ац>100аш>NK1

 

 

 3         4         2         1   

 

3

Эмульсификаторы

100аш>NK1>Aц>>K3III24[нет]

 

 2         1         4         3

4

Выраженность продуктов Майларда

после термообработки [D420]

К3III24≥NK1>100аш>Ац

 

 

 3         1         2         4 

 

5

Продукция аминокислот

NK1>K3III24>Ац>100аш               

 

 1        3          4         2

 

5.1

Tyr  (сайты расщепления сериновой

         протеиназой, флуорофоры)   

К3III24>100аш≥Ац>NK1

 

 

  3        2         4         1

 

5.2

Phe (сайты расщепления сериновой

        протеиназой, флуорофоры)

NK1>Ац>K3III24>100аш 

 

 

  1        4         3         2

5.3

Флуорофоры (Trp, Tyr, высокомолекулярные)

(возбуждение при 254 нм)

100аш>K3III24>NK1>Ац

 

 

 2         3         1         4

5.3.1

Высокомолекулярные флуорофоры

(возбуждение при 365 нм)

100аш>K3III24>NK1>>Ац                  

 

 

 2          3         1        4

5.4

Gly  (гидрофобная, антиадгезин)  

NK1>Ац>K3III24>100аш  

 

 1          4         3         2

5.5

Leu   (гидрофобная, сайты для пептидаз)

         (параметр слабо зависит от штамма)

K3III24>100аш≥Ац=NK1

 

 

 3         2       4-1      1-4

 

5.6

Ile    (гидрофобная, связана с биосинтезом

регуляторных ЛЖК) 

K3III24>100аш >Ац>NK1 

 

 3         2         4          1

5.7

Ala   (из состава пептидогликана клеточных

        стенок, сайты для эндо- и экзопептидаз)

Ац>K3III24=100аш>NK1

 

 

4       3-2       2-3       1

5.8

Ser   (сайты гликозилирования)  

Ац>K3III24>100аш>NK1             

 

 4         3         2         1

 

5.9

Thr  (сайты гликозилирования)

NK1>100аш>Ац>K3III24  

 

 1         2         4         3

 

5.10

Lys  (из катионных полипептидов, сайты

         расщепления сериновой протеиназой,

         участие в реакции Майларда)

Ац>100аш>K3III24>NK1 

 

 

 

 4          2         3         1

 

5.11

Val  (гидрофобная, участие в биосинтезе

        регуляторных летучих жирных кислот)    

K3III24>100аш>NK1>Ац             

 

 

 3         2         1         4

 

5.12

Glu/Gln  (сайты для амидаз)

NK1>Ац≥K3III24>100аш    

 

1          4         3         2

 

5.13

Asp/Asn (cайты гликозилирования, 

          сайты для амидаз

Ац≥100аш>NK1>K3III24                  

 

 

 4         2         1         3

 

5.14

His    (участие в аутоокислении белка

          [сходство с Trp], связывании катионов

          металлов, активации оксидаз и гема)

Ац>NK1>100аш>К3

 

 

 

 4         1         2         3

 

5.15

Arg   (из катионных полипептидов, разрушение

         при пигментообразовании в  реакции

         Майларда)

Ац >NK1>K3III24>100аш

 

 

 

 4         1         3         2

 

5.16

Met   (антиоксидант)

NK1>Ац>K3III24>100аш     

 

1          4         3         2

5.17

Cys2 (результат окисления сульфгидрильных

          групп в дисульфидные связи)

K3III24>NK1>Ац>100аш[нет]

 

 

 3         1         4         2        

 

5.18

Pro  (Pro-изгибы регулярной структуры в белках,

         низкое содержание в супернатантах)

100аш>Ац>K3III24>NK1[следы]

 

 

 2         4         3         1

 

5.19

Атибактериальная активность

Ац>NK1>100аш>K3III24

 

4          1         2          3

 

Примечание. *1= NK1, 2= 100аш, 3= К3III24, 4= Ацилакт.