Биологические науки/ 6.Микробиология

Видасов В.В.¹, к.б.н. Балко О.Б.², д.мед.н. Авдєєва Л.В.²

¹ - Національний університет харчових технологій, м. Київ, Україна

² – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Особливості отримання окремих типів бактеріоцинів Pseudomonas aeruginosa

Пріоритетним напрямком сучасної мікробіології вважається пошук альтернативних антибіотикам засобів впливу на мікроорганізми [1]. Серед широкого арсеналу факторів бактеріального антагонізму одними із перспективних є бактеріоцини – гетерогенні антибіотикоподібні речовини, які синтезуються мікроорганізмами для конкурентного антагонізму щодо близькоспоріднених видів [2]. Значне розповсюдження явища бактеріоциногенії, висока антибіотична активність і вузький спектр дії забезпечують високий потенціал застосування бактеріоцинів [3].

В проведених нами раніше дослідженнях було показано, що серед бактерій роду Pseudomonas виявляється значна кількість бактеріоциногенних штамів [4]. При цьому встановлено, що деякі культури псевдомонад здатні виділяти речовини, які пригнічують ріст 75-90% штамів того ж виду. В результаті із загальної кількості отриманих лізатів було відібрано 11 із найбільш широким спектром дії. Проте, у зв’язку із невисоким вмістом кіллерних часток дані лізати характеризувались відносно низькими показниками активності. Проведення оптимізації індукції за допомогою підбору оптимальних умов культивування штаммів-продуцентів дозволило підвищити активність отримуваних бактеріоцинів в 256 разів і досягнути при цьому показника 6,5 млн ОА/мл [5]. Встановлено, що клітини P. аeruginosa здатні продукувати бактеріоциноподібні речовини також і у складі біоплівки, що вказує на нові можливості їх застосування в процесах міжбактеріального антагонізму [6]. Проте відомо, що для P. aeruginosa може бути характерною множинність виділення бактеріоцинів [7].

Тому метою нашої роботи була перевірка множинності та розділення високоактивних лізатів на окремі фракції із бактеріоцинами різних типів.

Об’єктами досліджень в даній роботі були бактеріоцини, індуковані із колекційних штамів Pseudomonas aeruginosa (УКМ, Українська колекція мікроорганізмів). Для отримання лізатів добові культури штамів-продуцентів розводили у співвідношенні 1:20 (по об’єму), підрощували протягом 3 год і вносили індуктор - налідиксову кислоту до кінцевої концентрації 100 мкг/мл. Кілерну активність лізатів встановлювали методом «двошарового агару» на індикаторних культурах P. aeruginosa УКМ В – 3 та УКМ В – 10. Кількісні показники активності лізатів встановлювали за найбільшим серійним двократним розведенням, при нанесенні якого спостерігалась поява зон лізису. Отримані показники перераховували на 1 мл лізату і виражали в ОА/мл або в тис. ОА/мл чи млн. ОА/мл. Осадження та розділення бактеріоцинів проводили за допомогою ультрашвидкісного центрифугування при 215 тис. g протягом 1 години на ультрацентрифузі Backman (ротор SW-40). Первинні супернатанти піддавали повторному ультрацентрифугуванню при вказаних умовах протягом 4-х год і отримували вторинні осади і супернатанти. Розділення бактеріоцинів у складі вихідних лізатів проводили також за допомогою їх діалізу проти 0,9% розчину хлориду натрію (ФР) при 4 °С протягом однієї доби. Отримані діалізати відбирали, повторно вносили ФР, описаний процес проводили трьохкратно.

Первинним етапом роботи було напрацювання високоактивних лізатів P. aeruginosa, які містили у своєму складі бактеріоцини. Речовини, отримані із штамів P. aeruginosa УКМ В-9, УКМ В-330, УКМ В-332, УКМ В-333, УКМ В-335 та УКМ В-353, відносно чутливого штаму УКМ В-3 характеризувались наступними показниками активності: 102,4; 204,8; 204,8; 102,4; 51,2 та 409,6 тис. ОА/мл, відповідно. Відносно індикаторної культури УКМ В-10 активність індукованих лізатів була значно вищою – 819,2; 1638,4; 819,2; 204,8; 409,6 і 3276,8 тис. ОА/мл, відповідно. Таким чином, навіть на первинному етапі отримання, бактеріоцини із різних штамів суттєво відрізнялись між собою за показниками активності. Максимально активними виявились речовини, індуковані із P. aeruginosa УКМ В-353, тоді як частки із УКМ В-333 характеризувались мінімальними показниками кілерної активності.

Проведення високошвидкісного ультрацентрифугування дозволило суттєво підвищити активність отримуваних речовин. Серед усіх зразків найвищі показники були характерні лізатам P. aeruginosa УКМ В-353, активність яких щодо обох індикаторних культур переважала аналогічні показники речовин інших штамів у 4-16 разів. Проведення повторного ультрацентрифугування отриманих супернатантів протягом 4 год забезпечило більш інтенсивне осадження бактеріоцинів. В даному випадку показники кілерної активності вторинних осадів переважали відповідні показники їх первинних аналогів у 4-16 разів. При цьому, вторинне осадження виявилось більш рівномірним, оскільки активність бактеріоцинів із УКМ В-330, УКМ В-332, УКМ В-333 підвищувалась до 8,192 млн ОА/мл, а кілерних факторів інших штамів була лише вдвічі нижчою. Таким чином, застосування ультрацентрифугування дозволило отримати висококонцентровані зразки бактеріоцинів, проте не забезпечило їх розділення на окремі активні фракції.

В подальшому, розділення індукованих бактеріоцинів P. aeruginosa здійснювали методом діалізу. Було встановлено, що використання даного методу дозволило виділити зі складу вихідних лізатів P. aeruginosa УКМ В-9, УКМ В-330, УКМ В-332, УКМ В-333, УКМ В-335 та УКМ В-353 низькомолекулярні речовини, активність яких становила від 0,8 (із УКМ В-333) до 102,4 тис. ОА/мл (із УКМ В-353). Діючими компонентами даних діалізатів очевидно є низькомолекулярні бактеріоцини, які доповнюють та розширюють спектр антимікробної активності високомолекулярних бактеріоцинів P. aeruginosa. Натомість, діалізати P. aeruginosa УКМ В-332 та УКМ В-335 на індикаторні культури УКМ В-3 та УКМ В-10 не впливали. Вказана особливість може свідчити про відсутність у складі отриманих речовин часток із антимікробними властивостями або ж на необхідність застосування інших індикаторних культур, до яких дані частки будуть активними.

Отримані результати свідчать, що при індукції досліджуваних штамів P. aeruginosa відбувається виділення суміші бактеріоцинів, які представлені частками із високою та низькою молекулярною масою. Активність бактеріоцинів у лізатах із різних штамів-продуцентів суттєво коливається, що може свідчити про наявність у їх складі близьких, проте не ідентичних кілерних факторів. Описане свідчить про необхідність комплексного підходу при розділенні та концентруванні бактеріоцинів, представлених у складі лізатів.

Література:

1. Ling H., Saeidi N., Rasouliha B.H., Chang M.W. A predicted S-type pyocin shows a bactericidal activity against clinical Pseudomonas aeruginosa isolates through membrane damage // FEBS Lett. – 2010. – 584, N 15. – P. 3354-3358.

2. Riley M.A., Chavan M. Bacteriocins: ecology and evolution. – Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 2007. – 154 p.

3. Gillor O., Etzion A., Riley M.A. The dual role of bacteriocins as anti- and probiotics // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2008. – 81, N 4. – P. 591–606.

4. Балко А.Б., Авдеева Л.В. Скрининг продуцентов бактериоциноподобных веществ, активных по отношению к Pseudomonas aeruginosa // Микробиол. журн. – 2012. – 74, № 2. – С. 8-13.

5. Балко А.Б., Видасов В.В., Авдеева Л.В. Оптимизация условий индукция бактериоцинов Pseudomonas aeruginosa // Мікробіол. журн. - 2013. - Т. 75, № 1. – С. 58-64.

6. Писаренко П.А., Балко О.Б., Авдеева Л.В. Вплив умов культивування на інтенсивність виділення бактеріоциноподібних речовин Pseudomonas aeruginosa у складі біоплівки // Матеріали міжнародної науково-практичної конференції «Мікробні біотехнології: актуальність і майбутнє – Radostim-2012». – Київ, 2012. – С. 238-239.

7. Michel-Briand Y., Baysse C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa // Biochimie. – 2002. – 84, N 5. – P. 499–510.