Маракушин Д.И., Наконечная O.A., Стеценко С.А.

Харьковский национальный медицинский университет, Украина

УДК: 547.152.199.2:547.395:612.26:616.36-099-036.11-092.9

СОСТОЯНИЕ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ СИСТЕМЫ ГЕПАТОЦИТОВ И ТКАНЕВОГО ДЫХАНИЯ В ПОДОСТРОМ ОПЫТЕ ПОД ВЛИЯНИЕМ ОКСИЭТИЛИРОВАННЫХ АЛКИЛФЕНОЛОВ

В работе изучено влияние АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25 в дозах 1/10 и 1/100 ДЛ₅₀ на состояние монооксигеназной системы гепатоцитов и тканевого дыхания у крыс в подостром эксперименте. Ксенобиотики оказывают ингибирующее влияние на процессы биоэнергетики, приводят к разобщению тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования, стимулируют монооксигеназную систему микросом гепатоцитов, СРП и ПОЛ.

Ключевые слова: монооксигеназная система гепатоцитов, тканевое дыхание, неонолы

В процессе эволюции в живых организмах сформировались ферментные системы, которые обеспечивают их выживание в условиях агрессивного химического окружения. Эти системы представлены многочисленными ферментами, которые осуществляют окисление, восстановление, гидролиз и конъюгацию чужеродных соединений. Большинство ксенобиотиков, которые поступают в организм, подвергаются многочисленным превращениям, основной целью которых является повышение водорастворимости и снижение токсичности. Биотрансформация химических веществ тесно связана с метаболизмом эндогенных субстратов и для многих ферментов установлены как ксенобиотические, так и эндобиотические соединения [1]. Нередко, в процессе метаболизма химических веществ образуются реакционносособные интермедиаты и активные формы кислорода (АФК), которые ковалентно связываются с клеточными макромолекулами, компонентами мембран и активируют оксидативный стресс. Существенный вклад в обеспечение механизмов формирования которого вносят структурно-функциональное состояние монооксигеназной системы микросом и дыхательной цепи электронного транспорта митохондрий клеток различных органов, тканей и, в первою очередь, печени, почек, легких, надпочечников и др. [1, 2]. Ведущим

звеном в биотрансформации гидрофобных ксенобиотиков и эндогенных токсинов является монооксигеназная система, которая представлена цитохромами Р-450 и b₅, НАДФН- и НАДН - редуктазами. Особенностью монооксигеназной системы является ее способность к индукции под влиянием многих химических агентов экзо - и эндогенного происхождения. Индукция данной системы носит приспособительный характер. Она ускоряет элиминацию ксенобиотиков из организма. Однако, существуют и ее вредные последствия: активация канцерогенеза, нарушение обмена витаминов и гормонов, возникновение порфирий и усиление токсификации организма [1,2]. Известно, что индукция или блокирование активности метаболизирующих ферментов эндоплазматической сети, митохондрий, пероксисом, лизосом может существенно влиять на превращение ксенобиотиков в организме и развитие патологических состояний, которые сопряжены с усилением процесса старения [1-3]. Для оценки резервных возможностей, степени устойчивости организма к вредным факторам окружающей и производственной среды, наиболее адекватными являются методы изучения модифицированного действия химических загрязнителей на уровне микросомальной оксигеназной системы с параллельным исследованием возможных неблагоприятных эффектов на уровне мембранно-структурных ферментов [1,2]. Основной структурно-функциональной единицей, осуществляющей эти процессы, является эндоплазматическая сеть гепатоцитов, а именно ферментная система микросомальной мембраны, участвующая в детоксикации неполярных химических чужеродных соединений. При этом, особый интерес представляют исследования метаболических процессов в митохондриях экспериментальных животных, которые подвергались воздействию вредных химических веществ. Известно, что важнейшим звеном, обеспечивающим функционирование восстановительных синтезов, являются биоэнергетические процессы и связанные с ними реакции поглощения неорганического фосфора и потребления кислорода, которые сопровождаются генерацией макроэргических субстратов в дыхательной электронно-транспортной цепи митохондрий. Чрезмерная активация дыхательной цепи, как и ее ингибирование, могут быть тесно связанными с влиянием на организм ксенобиотиков и их метаболитов обмена. Имеющиеся в литературе данные о функциональном состоянии митохондрий указывают на существенные нарушения процессов дыхания и окислительного фосфорилирования в условиях токсификации организма [1-3]. Как правило, степень выраженности этих изменений зависит от стадии патологического процесса [3,4]. Анализ и оценка состояния микросомального окисления, процессов дыхания и окислительного фосфорилирования, как основных генераторов АФК свидетельствует об актуальности оценки их структурно-функционального состояния при изучении воздействия ксенобиотиков на организм теплокровных животных. В связи с вышесказанным, целью работы являлось изучение влияния новой группы детергентов на монооксигеназную систему микросом гепатоцитов и сопряженные процессы тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в дыхательной электронно-транспортной цепи митохондрий в условиях подострого токсикологического эксперимента.

Материалы и методы исследования. Выбор группы поверхностноактивных веществ (ПАВ) как объектов настоящего исследования в значительной мере обоснован большими объемами производства, широким ассортиментом продукции на их основе, отсутствием сведений о потенциальной опасности для человека и окружающей среды. Исследованию подвергались оксиэтилированные алкилфенолы (ОА) на основе тримеров пропилена общей формулой: С₉Н₁₉ - С₆Н₄₀ - (С₂Н_4о)_nН, где n - степень оксиэтилирования 10, 12 и 25 соответственно - неонол АФ9-10, неонол АФ9-12, неонол АФ9-25. Неонолы АФ9-10, АФ9-12 на основании параметров острой токсичности относятся к умеренно токсичным (3 класс опасности), а неонол АФ9-25 - к малотоксичным соединениям (4 класс опасности), которые обладают высокими кумулятивными свойствами. Среднесмертельные дозы (ДЛ₅₀) были установлены на уровнях 4,3±0,6; 3,4±0,7; 9,1 ±0,8 г/кг массы животного, а коэффициенты кумуляции были определены на уровнях 3,0; 2,2 и 2,8 соответственно для АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25. Экспериментальная часть исследования выполнялась на белых крысах популяции WAG, которым ежедневно, утром натощак с помощью металлического зонда перорально вводились водные растворы ксенобиотиков из расчета 1/10; 1/100; 1/1000 ДЛ₅₀. Продолжительность подострого эксперимента составляла 45 суток. Опыты на белых крысах проводились с соблюдением международных принципов европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для опытов и других научных целей (г. Страсбург, 1985) и «Общеэтических принципов экспериментов на животных», одобренных Первым национальным конгрессом по биоэтике (г.Киев, 2001) и закона Украины «О защите животных от жестокого обращения» от 21.02.06 №3477.

Программа исследования предусматривала изучение влияния неонолов на две микросомальные электронно-транспортные системы: НАДФН-связанную с цитохромом Р-450 в качестве конечного звена и НАДН-систему, связанную с цитохромом b₅ в качестве акцептора электронов. Исследовали такие параметры микросомального окисления как дыхательная активность, содержание цитохромов Р-450, b₅, активность редуктаз. Наиболее полно и объективно активность системы микросомального окисления может быть оценена по скорости метаболизма ксенобиотиков, что отражает активность как начальных (НАДФН, НАДН-редуктаз), так и терминальных (цитохромы Р-450, b₅) участков. В качестве субстрата микросомальной Р-450 - зависимой системы использовали р-нитроанизол - ксенобиотик, подвергающийся окислительному метилированию с образованием р-нитрофенола, обладающего характерным спектром поглощения в щелочной среде. В работе использовали такие параметры микросомального окисления как активность О-деметилазы, НАДФН- цитохром с-редуктазы, НАДН-цитохром с-редуктазы, скорость эндогенного дыхания микросом, скорость окисления НАДФН, скорость окисления НАДФН в присутствии ЭДТА, скорость перекисного окисления липидов (ПОЛ) и содержание цитохромов Р-450 и b₅ [4]. Оценку метаболического состояния митохондрий производили полярографически, определяя скорость потребления кислорода в присутствии акцептора (υ₃), скорость потребления кислорода в присутствии разобщителя - 2,4- дини-трофенола (2,4-ДНФ) после исчерпывания добавляемого АДФ (υ₄), а также рассчитывали: 1) отношение АДФ/O₂, сходное по своему значению с коэффициентом Р/О и характеризующее сопряженность процессов окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи; 2) дыхательный коэффициент (ДК) Ларди - отношение скорости поглощения кислорода в состоянии «3» к скорости поглощения кислорода в состоянии «4» (до ввода в ячейку АДФ); 3) активность АТФ-гидролазных реакций как отношение υ₃/ υ₄, характеризующее

скорость регенерации АДФ после его фосфорилирования. В качестве субстрата

окисления использовали сукцинат [5,6]. Определение Са²⁺, Mg²⁺ - зависимой АТФ-азы в гепатоцитах осуществлялось общепринятым методом [5]. Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента-Фишера.

Результаты и их обсуждение. Изучение влияния неонолов в подостром опыте на белых крысах выявило усиление активности всех исследуемых параметров микросомального окисления в монооксигеназной системе гепатоцитов под воздействием 1/10 и 1/100 ДЛ₅₀. Доза 1/1000 ДЛ₅₀ не влияла на состояние гидроксилирующей системы детоксикации чужеродных химических соединений. Так, исследования показали, что неонолы марок АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25 повышали соответственно 0-деметилазную активность под воздействием 1/100 ДЛ₅₀ в 2,5; 2,2 и 1,8 раза по сравнению с группой контроля (табл. 1). НАДФН-цитохром с -редуктазная и НАДН-цитохром с-редуктазная активность при этой дозе воздействия во всех случаях увеличивалась больше чем на 40%. Скорость эндогенного дыхания при пероральном поступлении неонолов АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25 повышалась соответственно в 2,3; 2,1 и 1,7 раза. Кооперативно наблюдалось и повышение скорости окисления НАДФН для всех ксенобиотиков более чем в 1,6 раза. Скорость окисления НАДФН в присутствии ЭДТА увеличивалась в 2,25; 2,04 и 1,46 раза соответственно при действии неонолов АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25. Изучаемые ПАВ марок АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25 усиливали ПОЛ соответственно в 5,0; 4,4 и 3,9 раза. Содержание цитохрома Р-450 повышалось более чем в 1,8 раза, а цитохрома b₅ - более чем в 1,6 раза при воздействии исследуемых веществ. Анализ показывает, что неонолы в условиях подострого воздействия значительно стимулируют свободнорадикальные процессы (СРП), ПОЛ, усиливают потребление кислорода микросомами печени, активируют монооксигеназную систему детоксикации ксенобиотиков. Такие изменения активности микросомальной гидроксилирующей системы гепатоцитов могут быть сопряжены с накоплением АФК, свободных радикалов, перекисей, гидроперекисей и других реакционноспособных молекул, обладающих мембраноповреждающим действием.

Таблица 1. Влияние неонолов на систему микросомального окисления в подостром опыте под воздействием 1/100 ДЛ₅₀

Показатели	Вещества (М±m)
	Контроль	АФ9-10	АФ9-12	АФ-9-25
0-деметилаза (нмоль р- нитро-фенола/мин∙мг белка)	6,70±0,58	16,7±1,4*	14,8±1,2*	12,3±0,9*
НАДФН-цитохром с-редуктаза (нмоль цитохрома с/мин∙мг белка)	180,4±17,3	280,2±18,9*	265,3±15,4*	245,8±12,6*
НАДН-цитохром с-редуктаза (нмоль цитохрома с/мин∙мг белка)	865,2±57,8	1407,8±83,4*	1395,6±70,2*	1276,4±60,5*
Скорость эндогенного дыхания (нмоль О2/мин∙мг белка)	1,50±0,21	3,45±0,27*	3,20±0,22*	2.60±0,18*
Скорость окисления НАДФН (нмоль О2 /мин∙мг белка)	3,20±0,34	7,10±0,58*	6,54±0.46*	5,28±0,42*
Скорость окисления НАДФН в при-сутствии ЭДТА (нмоль О2/мин∙мг белка)	2,80±0,32	6,30±0,70*	5,73±0,66*	4,±0,53*
Скорость перекисного окисления липидов (нмоль О2/мин∙мг белка)	0,44±0,07	2,20±0,16*	1,95±0,18*	1,70±0,12*
Содержание цитохрома Р-450 (нмоль/мин∙мг белка)	0,865±0,07	1,94±0,09*	1,72±0,10*	1,63±0,08*
Содержание цитохрома b5 (нмоль/мин∙мг белка)	0,582±0,06	1,25±0,08*	1,14±0,07*	0,92±0,06*

Примечание: * -различия достоверные р<0,05.

Важнейшим фактором, обеспечивающим функционирование восстановительных синтезов, являются биоэнергетические и связанное с ними сопряжение тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования, которые сопровождаются генерацией макроэргических субстратов и, в первую очередь, АТФ [6]. В связи с этим, актуальным являлось изучение влияния ксенобиотиков в субтоксической дозе (1/100 ДЛ₅₀) на метаболическое состояние митохондрий в условиях подострого токсического эксперимента. Результаты исследований показали, что скорость окисления сукцината ферментом сукцинатдегидрогеназой в метаболическом состоянии митохондрий опытных групп животных снижалась по сравнению с контролем (табл. 2).

Таблица 2. Влияние неонолов в подостром опыте на метаболическое

состояние митохондрий гепатоцитов под воздействием 1/100 ДЛ₅о

Показатели	Вещества (М±m)
	Контроль	АФ9-10	АФ9-12	АФ-9-25
Дыхание после добавления сукцината (υ4); (нмоль О2/мин∙мг белка)	1,76±0,24	1,20±0,08*	1,43±0,07*	1,36±0,05*
Дыхание после добавления АДФ (υ3); (нмоль О2/мин∙мг белка)	6,23±0,35	3,17±0,26*	3,29±0,30*	3,48±0,42*
Дыхание после добавления 2,4-ДНФ ( υ4); (нмоль О2/мин∙мг белка)	7,38±0,52	3,80±0,21*	3,98±0,24*	4,50±0,43*
ДК= υ3/ υ4 (отн. ед.)	3,88±0,22	2,12±0,18	2,16±0,21	2,20±0,16
Коэффициент фосфорилирования АДФ/02	2,79±0,35	1,26±0,07*	1,24±0,12*	1,31±0.08*
Mg^2^+-ATФ-aзa (мкмоль Р/мгбелка∙час)	82,50±3,80	57,20±3,86*	53,5±4,10*	59,60±4.43*
Са^2^+-АТФ-аза (мкмоль Р/мг белка∙ час)	68,70±2,45	49,20±2,75*	52,40±3.60*	48,25±3„10*
Н^+-АТФ-аза (мкмоль Р/мг белка∙ час)	77,40±2,90	41,50±3,62*	43,27±3,94*	42,80±2.86*

Примечание: * различия достоверные р<0,05.

Следует отметить, что активность сукцинатдегидрогеназы под воздействием АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25 соответственно снижалась на 31,8% , 18,7% и 22,7%. Учитывая тесную связь фермента с внутренней мембраной митохондрий, можно предполагать, что ксенобиотики нарушают ее структурно-функциональное состояние и физико-химические свойства: мембранную проницаемость, вязкость, заряд, гидрофобный объем, полярность в результате активации ПОЛ и СРП. Многочисленные исследования свидетельствуют, что состояние физико-химических свойств мембран тесным образом сопряжено с нарушением биоэнергетических и синтетических процессов [5,6]. Экспериментальное изучение метаболического состояния митохондрий гепатоцитов крыс контрольной группы показало достаточно высокий его уровень по всем анализируемым показателям и энергетическим состояниям. Так, добавление акцептора в состоянии υ₃ и дополнительно разобщителя 2,4- ДНФ в состоянии υ₄ обнаружило увеличение скорости дыхания в присутствии сукцината и АДФ, связанного со снижением мембранного потенциала в контрольной группе наблюдения [6]. Неонолы АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25 снижали дыхание после добавления АДФ соответственно на 49,2%, 47,2% и 54,2%. Сходная динамика ингибирования дыхания наблюдалась и при добавлении разобщителя 2,4-ДНФ, который снижал эти процессы на 48,5%, 46% и 39% соответственно при действии неонолов АФ9-10, АФ9-12 и АФ9- 25. Дыхательный коэффициент при этом снижался на 45,4%, 44,9% и 43,3% соответственно при действии АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25. При этом дыхательный коэффициент, который измеряли как отношение υ₃/υ₄ в интактной (контрольной) группе составлял 3,5±0,24 отн. ед., что свидетельствовало о высоком уровне энергетического состояния митохондрий, гепатоцитов животных, которые не подвергались воздействию химических веществ. Пероральное поступление ксенобиотиков привело к снижению дыхания в метаболическом состоянии υ₃, которое отображает активность дыхательной цепи при функционировании Н⁺-АТФ-синтетазы [5]. При этом наблюдали снижение скорости дыхания в присутствии 2,4-ДНФ, что сопровождалось снижением дыхательного коэффициента до 0,8; 0,6 и 0,79 соответственно при действии неонолов АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25. Исследования обнаружили, что ксенобиотики приводили в условиях подострого воздействия на крыс к снижению окислительного фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов и увеличивали долю свободного дыхания. Об этом свидетельствовало снижение интенсивности дыхания в безакцепторной среде в третьем метаболическом состоянии (υ₃) после добавления АДФ. Дыхательный коэффициент (отношение υ₃/υ₄) и коэффициент фосфорилирования (АДФ/О₂) существенно снижались у опытных групп животных, что позволило судить о разобщении дыхания и окислительного фосфорилирования [7]. Регенерация АДФ при оценке АТФ- гидролазной реакции снижалась также в опытных группах животных сравнительно с контролем. Выраженное угнетение дыхания в метаболическом

состоянии υ₃ указывает на снижение интенсивности реакций окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ, что может быть связано с изменением структуры митохондрий и ее фрагментации. Эти данные подтверждались ингибированием активности Мg²⁺-АТФ-азы на 30,7%, 35,2% и 27,8% соответственно при действии неонолов АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25. Аналогичная динамика снижения активности была присуща и Са²⁺-АТФ-азе.

Результаты исследований свидетельствуют, что ксенобиотики в дозах 1/10; 1/100; 1/1000 ДЛ₅₀ приводят к изменению структурно-метаболического состояния митохондрий, которое проявляется нарушением окислительного фосфорилирования и тканевого дыхания, снижением продукции макроэргических субстратов, и, в первую очередь, АТФ. Данные нарушения метаболического состояния митохондрий гепатоцитов имели высокую корреляционную связь (г=0,92) с активностью аденозинтрифосфотаз (Н⁺-АТФ-азы, Mg²⁺-АТФ-азы). Поскольку активность АТФ-аз митохондрий связывают с процессами окисления и фосфорилирования, эти данные представляют значительный интерес для понимания структурно-метаболических механизмов формирования патогенеза интоксикации организма крыс, подвергавшихся воздействию АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25.

Согласно химической теории сопряжения Митчелла, а также исследованиям В.П. Скулачева [6], В.М. Денисова и соавт. [5] активация фермента Н⁺-АТФ-синтетазы наблюдается при увеличении протонной проницаемости митохондрий. Снижение активности фермента Н⁺-АТФ- синтетазы, наблюдаемое при субтоксической интоксикации ксенобиотиками, является одним из звеньев разобщения окисления и фосфорилирования. Следовательно, и уменьшения энергопродукции и интенсивности восстановительных синтезов, направленных на устранение нарушенных звеньев в обмене веществ [4-6].

Выводы. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о том, что АФ9-10, АФ9-12 и АФ9-25 в дозах 1/10 и 1/100 ДЛ₅₀ оказывают ингибирующее влияние на процессы биоэнергетики, приводят к разобщению тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования, стимулируют гидроксилирующую монооксигеназную систему микросом гепатоцитов, СРП и ПОЛ, формируя при этом патологические реакции, в основе которых лежит мембранная патология, энергетический голод и тканевая гипоксия клеток, представляющих ведущие звенья формирования дистрофических и деструктивных нарушений.

Список литературы

1. Сидоренко Г.И. Методические и теоретические аспекты гигиены окружающей среды / Г.И. Сидоренко // Гигиена окружающей среды в СССР. - Москва: Медицина. - 1989. - С. 5-14.

2. Цыганенко А.Я. Методические основы регламентации сложных смесей: триэтаноламиновых солей алкилфосфатов и алкилполифосфатов в воде водоемов / А.Я. Цыганенко, Н.Г. Щербань, JI.A. Бондаренко [и др.]. - Белгород, 2001. - 178 с.

3. Григорова И.А. Этиология и патогенетические механизмы модельного атерогенеза / И.А. Григорова, Б.И. Григоров, В.Н. Погорелов [и др.]. - Харьков: РИП «Оригинал». - 1997. - 254 с.

4. Мясоедов В.В. Детергенты - модуляторы радиомиметических эффектов /

В.В. Мясоедов, Ю.И. Козин [и др.]. - Белгород, 2000. - 375 с.

5. Денисов В.М. Биохимия миокарда, поврежденного адреналином / В.М. Денисов, С.М. Рукавишникова, В.И. Жуков. - Харьков: РИП «Оригинал». - 1999.- 183 с.

6. Сукачев С.В. Нарушение метаболизма при развитии нейрогенных поражений сердца и влияние на них некоторых фармакологических средств / С.В. Сукачев, H.A. Новикова, В.А. Исаенко [и др.]. //Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1974. - №2. - С.50-51.

7. Попова Л.Д. Олигоэфиры - модуляторы радиомиметических эффектов Л.Д. Попова, В.И. Жуков, В.В. Мясоедов [и др.]. // Медицина сегодня и завтра. - ХГМУ. - 2004, №4. - С.51-59.