Радевич Д.С., Щеколова А.С., Ерошевская Л.А., Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

ПРОСТОЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Введение. Плазмидная ДНК (пДНК) широко применяется для вакцинирования и генной терапии. Использование в качестве лекарственного средства требует разработки эффективных способов ее очистки от потенциально токсичных или вызывающих иммунный ответ компонентов бактериальной клетки (геномная ДНК, РНК, белки, эндотоксины).

Несмотря на множество описанных в литературе методов, универсального способа выделения и очистки пДНК в настоящее время не существует. Главными недостатками существующих способов очистки являются трудоемкость, использование дорогостоящих реактивов и сложное аппаратурное оформление.

Исходя из вышеизложенного, цель настоящей работы заключалась в разработке простого и эффективного способа препаративной очистки пДНК.

Объекты и методы исследования. Конструирование штамма Escherichia coli CpG-KH11, продуцирующего пДНК, и условия его культивирования описаны нами ранее [1]. Из полученной биомассы клеток выделяли пДНК методами щелочного и теплового лизиса, а также методом осмотической экстракции согласно протоколам, описанным в [2], [3] и [4], соответственно. На всех этапах выделения и очистки пДНК ее образцы анализировали с помощью 0,8 % агарозного гель-электрофореза.

Эксперименты по подбору концентрации цетавлона для очистки пДНК проводились следующим образом. К «стартовому» раствору, полученному после щелочного лизиса клеток, добавляли цетавлон, смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин с последующим центрифугированием при 21 000 g в течение 10 мин. Полученный супернатант отбрасывали, а осадок суспендировали в растворах различного состава: дистиллированная вода, 10 мМ TE-буфер (pH 8,0), 0,1 М КФБ (pH 7,2), 3 M или 5 M хлорид натрия, 3 M ацетат калия, 0,5–3 M ацетат натрия. После центрифугирования к полученным надосадочным жидкостям добавляли 1 объем изопропанола. Смеси инкубировали на ледяной бане в течение 10 мин с последующим центрифугированием. Полученные осадки дважды отмывали от остатков цетавлона 80 %-ным этанолом и растворяли в TE-буфере.

Частично-очищенный препарат пДНК после обработки цетавлоном дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации. Для этого 5 мл образца, содержащего около 10 мг пДНК, наносили на колонку (l=30 см, d=3,6 см) со смолой Toyopearl HW-65. Элюцию проводили дистиллированной водой со скоростью 1 мл/мин.

Результаты и обсуждение. На первом этапе пДНК выделяли из клеток E. coli методами щелочного и теплового лизиса, а также методом осмотической экстракции (рис.1).

Рис. 1 Электрофореграмма плазмиды, выделенной с помощью: коммерческих колонок (1); метода осмотической экстракции (2–3); метода щелочного лизиса (4–5); метода теплового лизиса (6–7)

Из рис. 1 видно, что метод щелочного лизиса позволяет эффективно выделять плазмиду из клеток с незначительными примесями геномной ДНК. Методы теплового лизиса и осмотической экстракции характеризуются значительно более низким выходом пДНК и наличием геномной ДНК в полученных препаратах. Примесь РНК присутствовала во всех образцах, что потребовало дальнейшей очистки пДНК.

Дальнейшую процедуру очистки пДНК осуществляли с использованием сильного ионного детергента цетавлона, широко применяемого для разрушения мембран клеток, ДНК-белковых комплексов и отделения ДНК от полисахаридов. По литературным данным, концентрация цетавлона влияет на его способность осаждать ДНК из раствора в виде нерастворимых комплексов [5]. Поэтому на данном этапе определяли оптимальную концентрацию цетавлона, позволяющую селективно осаждать пДНК. Для этого к раствору пДНК, полученного после щелочного лизиса клеток, добавляли цетавлон до конечной концентрации 0,04–0,18 % (рис. 2).

Рис. 2 Электрофореграмма пДНК после осаждения цетавлоном в концентрации 0,04 % (1); 0,06 % (2); 0,08 % (3); 0,1 % (4); 0,12 % (5); 0,14 % (6); 0,16 % (7); 0,18 % (8).

M – (здесь и далее) фрагменты ДНК известного размера

Дополнительный анализ полученной электрофореграммы с использованием пакета программ TotalLab TL120 показал, что 0,08 % цетавлон обеспечивает полное осаждение пДНК из раствора с наименьшей примесью РНК.

На следующем этапе подбирали экстрагирующий раствор для извлечения пДНК из осадка. В экспериментах использовали растворы, описанные ранее. Полученные данные позволяют сделать вывод, что растворы с низкой ионной силой (дистиллированная вода, 10 мМ TE-буфер (pH 8,0), 100 мМ КФБ (pH 7,2), 0,5 М ацетат натрия) обладают низкой экстрагирующей способностью в отношении пДНК и РНК. При использовании растворов с высокой ионной силой (3 M и 5 M хлорид натрия, 3 M ацетат калия, 1 M и 3 M ацетат натрия) экстрагируется пДНК с примесью РНК, при этом 3 М ацетат калия позволяет экстрагировать пДНК из осадка с минимальной, по сравнению с другими образцами, примесью РНК (рис. 3).

Рис. 3 Электрофореграмма пДНК, полученной при ее экстракции из осадка различными растворами

1 – дистиллированная вода; 2 – 10 мМ TE-буфер (pH 8,0); 3 – 100 мМ КФБ (pH 7,2); 4 – 3 M NaCl; 5 – 5 M NaCl; 6 – 0,5 M CH₃COONa; 7 –1 M CH₃COONa;

8 –3 M CH₃COONа; 9 – 3 M CH₃COOK

Для окончательной очистки пДНК от низкомолекулярных примесей использовали гель-фильтрацию на смоле Toyopearl HW-65. Полученные результаты иллюстрирует рис. 4, из которого следует, что очищенная плазмида не содержит примесей РНК и геномной ДНК.

Рис. 4 Электрофореграмма пДНК после очистки с помощью

гель-фильтрации (1)

УФ-спектр очищенной плазмиды соответствовал спектру, характерному для ДНК. Соотношения светопоглощений А_260/280=1,9 и А_260/230=2,1 также свидетельствовали о высокой чистоте полученной пДНК [2].

Таким образом, нами предложен простой и эффективный подход к выделению и очистке пДНК, предусматривающий щелочной лизис бактериальных клеток, осаждение пДНК 0,08 % раствором цетавлона с последующей экстракцией 3 М раствором ацетата калия и гель-фильтрацией на смоле Toyopearl HW-65. Метод отличается от известных аналогов простотой аппаратурного оформления и использованием более доступных реагентов. Выход пДНК после всех стадий очистки составил около 60 %.

Литература:

1. Штамм Escherichia coli, продуцирующий плазмиду, обогащенную иммуностимулирующим CpG-мотивом: пат. 17996 Респ. Беларусь, МПК7 С 12N 1/21 / А.С. Коровашкина, С.В. Квач, А.И. Зинченко; заявл. 06.09.2011; опубл. 28.02.2014.

2. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. Frittsch, T. Maniatis. – 2-nd ed. – New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. – 2222 p.

3. A continuous thermal lysis procedure for the large-scale preparation of plasmid DNA / K. Zhu [et al.] // J. Biotechnol. – 2005. – Vol. 118, N 3. – Р. 257–264.

4. A one-step miniprep for the isolation of plasmid DNA and lambda phage particles / G. Lezin [et al.] // PLoS One. – 2011. – Vol. 6, N 8:e23457.

5. Fractional precipitation of plasmid DNA from lysate by CTAB / R.J. Lander [et al.] // Biotechnol. Bioeng. – 2002. – Vol. 79, N 7. – P. 776–784.