Рымко А.Н., Щеколова А.С., Квач А.С., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОЙ

ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗДИДМОНОФОСФАТКИНАЗЫ

БАКТЕРИОФАГА Т5 В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI

Дезоксинуклеозидмонофосфаткиназа (КФ 2.7.4.13, дНМФ-киназа), продуцируемая бактериофагом Т5, катализирует (в отличие от всех известных дНМФ-киназ) фосфорилирование всех четырех природных 2′-дезоксинуклеозид-5′-монофосфатов до соответствующих 2′-дезоксинуклеозид-5′-дифосфатов [1]. Широкая субстратная специфичность этого фермента открывает возможность его использования в качестве одного из ферментов для получения 2′-дезоксинуклеозид-5′-трифосфатов, пригодных для постановки ПЦР [2].

Ранее нами создан штамм Escherichia coli pdnkТ5, продуцирующий дНМФ-киназу бактериофага Т5 [3]. Целью настоящей работы была оптимизация условий экспрессии рекомбинантной дНМФ-киназы.

Объекты и методы исследования. Для культивирования клеток E. coli pdnkТ5 использовали среду LB с добавлением канамицина до конечной концентрации 100 мкг/мл.

На первом этапе исследования была проверена зависимость уровня продукции фермента от концентрации клеток в момент индукции. Для этого в культуральную жидкость (КЖ) вносили изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 ммоль/л при различных значениях оптической плотности клеток (от 0,6 до 3 о.е.; λ=600 нм). Анализ активности фермента проводили через 3 ч после внесения индуктора.

На следующем этапе настоящего исследования проверяли влияние температуры культивирования на продуцирующую способность полученного штамма. Клетки выращивали в условиях, описанных выше, индукцию синтеза белка осуществляли при температурах от 27 до 42 ^оС.

Далее изучали зависимость накопления целевого фермента от продолжительности инкубации штамма-продуцента после внесения индуктора (1–5 ч).

На заключительном этапе оптимизации экспрессии дНМФ-киназы изучали влияние индуктора (ИПТГ, лактоза) и его концентрации на уровень продукции целевого белка. Исследования проводили в условиях культивирования, подобранных в предыдущих экспериментах.

Цифровые данные, представленные в работе, являются усредненными величинами 3–4 определений с доверительным интервалом для 95% уровня вероятности.

Результаты и обсуждение.

При оптимизации экспрессии дНМФ-киназы изменяли следующие параметры культивирования: концентрацию клеток на момент внесении индуктора, температуру, время культивирования после внесения индуктора, вид индуктора и его концентрацию. Полученные данные представлены на рис. 1.

Как видно из рис. 1 А–В, оптимальными параметрами индукции синтеза дНМФ-киназы штаммом E. coli pdnkТ5 являются: оптическая плотность клеток на момент индукции 1,5–2 о.е., температура 32 ^оС, время культивирования 3–4 ч после внесения индуктора.

На заключительной стадии оптимизации экспрессии дНМФ-киназы установлено, что использование 0,2 % лактозы в качестве индуктора экспрессии гена дНМФ-киназы позволяет получать до 22 700 ед этого фермента из 1 л КЖ, что вполне сопоставимо с уровнем продукции данного белка при использовании ИПТГ в оптимальной концентрации – 0,5 мМ (27 000 ед/л КЖ, рис. 1 Г–Д). Принимая во внимание тот факт, что лактоза является доступным индуктором, ее использование является более целесообразным при наработке дНМФ-киназы в препаративных количествах, чем использование ИПТГ.

Таким образом, нами изучены параметры, влияющие на уровень продукции дНМФ-киназы бактериофага Т5 рекомбинантным штаммом E. coli pdnkT5. Установлено, что наиболее оптимальными условиями для индукции синтеза фермента являются: температура 32 ^оС, оптическая плотность (λ=600 нм) КЖ 1,5 о.е., концентрация лактозы 0,2 %. Выход дНМФ-киназы в этих условиях составляет 22 700 ед/л КЖ, что более чем в 2 раза превышает лучший результат, описанный в литературе [4].

Рис. 1 Зависимость продукции дНМФ-киназы штаммом E. coli pdnkТ5 от стадии роста рекомбинантных клеток (А), температуры культивирования (Б), продолжительности культивирования после внесения индуктора (В), концентрации ИПТГ (Г), концентрации лактозы (Д)

Литература:

1. Bessman, M. J. Purification and properties of the deoxynucleotide kinase induced by bacteriophage T5 / M.J. Bessman, S.T. Herriott, M.J. Van Bibber Orr // J. Biol. Chem. – 1964. – Vol. 240, N 1. – P. 439–445.

2. Субстратная специфичность дезоксирибонклеозидмонофосфат-киназы бактериофага Т5 и ее использование для синтеза [α-32P]d/rNTP / А.Ю. Скоблов [и др.] // Биоорганическая химия. – 2009. – Том 35, N 6. – C. 816–821.

3. Создание штамма Escherichia coli – суперпродуцента дезокси-нуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага T5 / А.Н. Рымко [и др.] // Молодежь в науке – 2012: приложение к журналу «Весцi НАН Беларусi», сер. бiял. навук. – 2012. – № 4. – С. 67–71.

4. Identification, cloning, and expression of bacteriophage T5 dnk gene encoding a broad specificity deoxyribonucleoside monophosphate kinase (EC 2.7.4.13) / G.V. Mikoulinskaia [et al.] // Protein Expr. Purif. – 2004. – Vol. 33, N 2. – P. 166–175.