Медицина/6.Экспериментальная и клиническая фармакология

Студ. В.Ю. Деркач, к.т.н. В.О. Красинько

Национальный университет пищевых технологий, Украина

Перспективы получения и применения дефензинов

Скорость развития антибиотикорезистентности у микроорганизмов превышает скорость создания и исследования новых антибиотических веществ, поэтому сегодня существует острая необходимость поиска альтернативных антибиотиков. Перспективным в этом направлении является исследование эндогенных антимикробных пептидов, синтезируемых иммунными клетками человека.

На сегодняшний день открыто 1393 антимикробных, 103 противовирусных, 553 противогрибковых пептидов. У млекопитающих идентифицировано более 500 различных антимикробных пептидов (АМП) [1,2,4]. У человека описано три семейства АМП – дефензины, кателицидины, гистатины. Дефензины, в свою очередь, делятся на группы в зависимости от типа клеток-продуцентов на α-дефензины ( HNP1-4, HD5-6), β-дефензины ( hBD ) и q-дефензины. Обнаруженные α- и β-дефензины человека различаются между собой месторасположением дисульфидных связей в молекуле и клетками-продуцентами [4,9].

Механизм действия АМП обусловлен образованием пор и каналов в цитоплазматической мембране, нарушением функционирования ДНК и РНК. Взаимодействие АМП с бактериальной мембраной происходит путем кумуляции молекул на внешней поверхности бактериальной мембраны (за счет электростатических взаимодействий), проникновения в липидный бислой мембраны и дестабилизации мембраны с нарушением ее целостности [1].

Дефензины человека представляют собой семейство амфифильных катионных, богатых цистеиновых остатками пептидов с молекулярной массой 3-4 кДа, молекулы которых состоят из 29-47 аминокислотных остатков [1,4]. Молекулы дефензинов отличаются высоким содержанием положительно заряженных аргининовых, лизинових остатков аминокислот с гидрофобными боковыми группами и обязательным наличием шести цистеиновых остатков, образующих три внутримолекулярных дисульфидных мостика, которые функционально стабилизируют молекулу, защищая её от деградации протеазами.

Дефензины проявляют выраженную бактерицидную активность в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий. Бактерицидное действие дефензинов включает в себя непосредственное взаимодействие с инфекционным агентом, порообразования в клеточной мембране бактерий. Отмечена зависимость бактерицидного эффекта дефензинов от концентрации хлорида натрия: при концентрации NaCl выше 150 мкмоль/л происходит резкое снижение бактерицидной активности. Максимальный бактерицидный эффект у α-дефензинов отмечается при значениях pH среды от 7 до 8. Вероятно, что pH среды влияет на взаимодействие пептида с клеткой-мишенью, изменяя конформацию молекулы пептида или молекулярных структур поверхности клеточной стенки бактерии [9,13].

Дефензины обладают выраженной противовирусной активностью в отношении ДНК- и РНК-вирусов. Пептиды во внеклеточном пространстве могут индуцировать агрегацию вирусов, например вируса гриппа, и увеличивать активность их поглощения нейтрофилами [10,11]. Дефензины нейтрализуют действие вирусных агентов, непосредственно связываясь с белками капсида или блокируют проникновение вируса в клетки (вирус СПИДа или простого герпеса), взаимодействуя со специфическими клеточными рецепторами.

Обнаружено, что пептиды HNP-1, HNP-2, HNP-3, аминокислотные последовательности которых отличаются только одним аминокислотным остатком, существенно отличаются по уровню противовирусной активности в отношении вируса гриппа. Так, HNP-1, HNP-2 обладают более выраженным противовирусным действием в отличие от HNP-3, а пептид HNP-4, аминокислотная последовательность которого существенно отличается от других миелоидных α-дефензинов, проявляет менее выраженное нейтрализующее действие в отношении гриппа А по сравнению с HNP-1, HNP-2, HNP-3 [10,11].

Миелоидные α-дефензины и β-дефензины HBD-2, HBD-3 обладают достаточно выраженной противогрибковой активностью. Обнаружено, что рекомбинантный HBD-2 обладает в 10 раз большей фунгицидностью, чем HBD-3. Механизм фунгицидной активности также обусловлен образованием пор в мембране [1].

Особый интерес вызывают данные, в которых прослеживается корреляция снижения уровня выработки дефензинов с развитием онкологических заболеваний. Согласно проведенным исследованиям в 82% образцов клеток злокачественной опухоли простаты и 90% образцов светлоклеточной карциномы почек уменьшена или полностью отсутствует экспрессия гена DEFB1, ответственного за синтез β-дефензина. Исследования вируса папилломы человека (ВПЧ), вызывающего рак шейки матки, показали, что экспрессия другого β-дефензина HBD-2 (кодируется геном DEFB4) значительно уменьшается при злокачественном плоскоклеточном интраэпителиальном поражении и плоскоклеточном раке по сравнению с незлокачественными плоскоклеточным интраэпителиальным поражением и нормальным цервикальным эпителием. Предполагают, что отсутствие или недостаток дефензинов способствует уклонению раковых клеток шейки матки от иммунного надзора. Вероятно, что введение дефензинов может восстановить нормальный противоопухолевый иммунитет. Кроме этого, β-дефензины способны взаимодействовать с неиммуногенным фрагментом антигена атипичной клетки и превращать его в иммуногенный [8,7].

Несмотря на то, что дефензинам характерна довольно низкая селективность, они имеют ряд преимуществ: способность быстро и эффективно убивать клетки патогенных микроорганизмов, обладают широким спектром действия, активны в отношении штаммов резистентных к классическим антибиотикам, а также характеризуются медленным развитием механизмов устойчивости у микроорганизмов. Лекарственные средства на основе дефензинов (исходя из известных на настоящий момент их функций) могут использоваться для лечения различных бактериальных, грибковых и вирусных инфекций, поскольку, теоретически, дефензины обладают низкой иммуногенностью, высокой биодоступностью и минимальным токсическим действием даже в высоких концентрациях [1,7,9].

Имеются сообщения о получении синтетических и рекомбинантных дефензинов. При разработке лекарственных средств на основе HBD возможно использование комбинаций различных представителей этого подсемейства.

На сегодняшний день на фармацевтическом рынке нет препаратов, содержащих дефензины в своем составе, что связано с новизной темы и недостаточным количеством проведенных доклинических и клинических исследований. Однако за рубежом существуют препараты, которые стимулируют синтез собственных дефензинов в организме. В Германии разработан пробиотический препарат, содержащий микроорганизмы – продуценты β - дефензинов ( hBD -5). Данный препарат действует только в кишечнике [10,11,13].

Для лечения хронических инфекций и для терапии злокачественных новообразований разрабатывают препарат «Пропес», содержащий биологически активные α- и β-дефензины, полученные из эмбриональной ткани животных путем контролируемого протеолиза [9]. Клиническими исследованиями было подтверждено стимулирующее влияние на синтез дефензинов иммунокорректорного препарата «Ликопид» у больных пиодермией [5]. Рассматривается эффективность наружного применения препаратов с дефензинами для заживления ран.

Исходя из вышеизложенного, актуальным является вопрос о разработке методов промышленного получения дефензинов. Одним из вариантов получения дефензинов является химический синтез. Искусственные последовательности молекулы дефензина были разработаны на основе 84 расшифрованных аминокислотных последовательностей, принадлежащих человеку, а также с учетом соответствующего распределения заряда [13]. Синтез антимикробных пептидов с заданной аминокислотной последовательностью был осуществлён посредством биосистемы Pioneer. В результате химический способ синтеза обеспечил синтез готовых пептидов дефензинов, однако для применения в медицине они должны быть в предформе с последующим протеолитическим расщеплением в организме человека. Таким образом, химический синтез может рассматриваться как метод получения дефензинов в небольшом количестве для проведения лабораторных исследований [13].

В природе дефензины синтезируются только клетками высших эукариотических организмов. Поэтому существует необходимость получения генно-инженерных культур микроорганизмов, содержащих гены синтеза человеческих дефензинов для биотехнологического получения последних. Растения также продуцируют дефензины, которые отличаются от человеческих расположением нескольких аминокислот. Растительные дефензины в перспективе могут найти применение в медицине и сельском хозяйстве, например, для обработки мяса с целью его лучшего хранения.

На сегодняшний день уже получены генно-инженерные штаммы микромицетов: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, бактерий Escherichia coli, дрожжей: Candida, Kluyveromyces, Pichia и др. для получения α- и β-дефензинов [14,15].

Подводя итог вышеизложенному, необходимо отметить, что дальнейшее исследование и разработка лекарственных препаратов на основе дефензинов является перспективным направлением современной биотехнологии. И хотя путем химического и микробного синтеза уже получены некоторые представители семейства дефензинов, остаются малоисследованными вопросы, касающиеся влияния самих дефензинов на штамм-продуцент в процессе его культивирования, а также неясны механизмы образования резистентности к АМП у микроорганизмов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абатуров, А. Е. Катионные антимикробные пептиды системы неспецифической защиты респираторного тракта: дефензины и кателиидины / А. Е. Абатуров // Теоретична медицина. – 2011. – № 7. – С. 161–170.

2. Антимикробные пептиды – первая линия антиинфекционной защиты женских половых путей / О. П. Лебедева, Н. A. Рудых, И. С. Полякова и др. // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. – 2010. – № 22, вып. 12. – С. 25–30.

3. Будихина, А. С. α-дефензины – антимикробные пептиды нейтрофилов: свойства и функции / А. С. Будихина, Б. В. Пинегин // Иммунология. – 2008. – №5. – С. 317–320.

4. Будихина, А. С. Дефензины – мультифункциональные катионные пептиды человека / А. С. Будихина, Б. В. Пинегин // Имунопатология, аллергология, инфектология. – 2008. – №2. – С. 31–40.

5. Влияние имунотропной терапии на уровень α-дефензинов у больных пиодермией / Е. А. Цывкина, Е. С. Феденко, А. С. Будихина, Б. В. Пинегин // Российский Аллергологический Журнал. – 2010. – №6. –С. 22–26.

6. Егоров, Ц. А. Защитные пептиды иммунитета растений / Ц. А. Егоров, Т. И. Одинцова // Биоорганическая химия. – 2012. – № 38. – С. 7–17.

7. Ильяшенко, М. Г. / Эндогенные антимикробные пептиды и их клинико-патогенетическая значимость при воспалительных заболеваниях кишечника / Ильяшенко М. Г., Тарасова Г. Н., Гусева А. И. // Медицинские науки. – 2012. – №2. – Режим доступа: http://www.science-education.ru/102-5922.

8. Лебедева, О. П. Врожденный иммунитет женских половых путей и его гормональная регуляция / О. П. Лебедева, Н. A. Рудых // Научные Ведомости БелГУ. Медицина. Фармация. – 2009. – № 12 (67). – С. 25–30.

9. Мамчур, В. И. Дефензины – эндогенные пептиды с антиинфекционными и противоопухолевыми свойствами // В. И. Мамчур, А. Э. Левых // Таврический медико-биологический вестник. – 2012. – Т. 15. – № 2. – С. 315–321.

10. Human defensins 5 and 6 enhance HIV-1infectivity through promoting HIV attachment / A. Rapista, J. Ding, B.Benito, Y. Lo, M. Neiditch, W. Lu, Th. L Chang // Retrovirology. – 2011. – Р. 67–77.

11. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal / Yang, D., Biragyn, A., Kwak, L.W., Oppenheim, J.J. // Trends Immunol. – 2002. – № 23. – Р. 291–296.

12. Paneth cell trypsin is the processing enzyme for human defensin-5 / D. Ghosh, E. Porter, B. Shen, S. K. Lee1, D. Wilk, J/ Drazba, S. P.Yadav, J. W. Crabb, T. Ganz // Nature immunology. – 2002. – vol. 2. – P. 583–590.

13. Patent WO 2001092309 A2, PCT/US2001/018057/ Human beta-defensin-3 (hbd-3), a highly cationic beta-defensin antimicrobial peptide / Hong Peng Jia, Paul B Mccray Jr, Brian C Schutte, Brian Tack; Applicant Univ Iowa Res Found – №6809181; Declared 06.12.2000; Publ. 06.12.2001.

14. Patent WO 2005007861 A2, PCT/DE2004/001516 / Method for the production and use of antimicrobial protein-inducing factors obtained from gram-negative bacteria / Jens-Michael Schroeder, Lars Schwichtenberg; Applicant Uni Klinikum Schleswig Holstei, Jens-Michael Schroeder, Lars Schwichtenberg – № 2005007; Declared 27.02.2007; Publ. 10.12.2008.

15. Patent WO 2006097464 A1, PCT/EP2006/060695/ Recombinant expression of defensins in filamentous fungi / Mogens Trier Hansen, Hans-Henrik Kristen Hoegenhaug, Kirk Matthew Schnorr; Applicant Novozymes As – № 060695; Declared 10.12.2007; Publ. 10.12.2008.