Медицина/7

Медицина/7. Клиническая медицина

к.м.н. Зубченко С.О.

Львовский национальный медицинский университет имени Данила Галицкого, Украина

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ TLR9 НА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТКАХ ПРИ РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЭПШТЕЙНА–БАРР (EBV) ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Относительно специфическое роспознование чужеродных молекулярных структур микроорганизмов осуществляют Tool-like рецепторы (TLRs), которые экспрессируются на многих клетках человеческого организма, в т.ч. иммунокомпетентных. Для этих рецепторов характерна очень низкая плотность экспрессии по сравнению с другими мембраносвязывающими белками. Уровень их экспрессии быстро возрастает в ответ на действие PAMP (pathogen-associated molecular patterns) инфекционных агентов и уменьшается при отсутствии специфических лиганд [2, 3].

TLR9 является представителем семейства TLRs, который реагирует на неметилированый CpG паттерн ДНК EBV. Доведено, что TLR9 в большей степени находиться в эндосомах EBV-тропных иммунокомпетентных клеток крови (В-лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, дендритные клетки, базофилы и т.д.) [6]. EBV стимулирует экспрессию TLR9 на указанных клетках с последующим синтезом прововоспалительных цитокинов, в частности TNF-a, INF-a, IL-6 и формированием воспалительной реакции. Причем, скорость TLR9-опосредованых клеточных реакций зависит от вида клеток, на которых активируются данные рецепторы. Например, в В-лимфоцитах протеолиз проходит с более высокой скоростью, потому что в этих случаях активированные вирусом TLR9 стимулируют MyD88-зависимый сигнальный путь запуска воспалительного ответа и усиливают апоптоз клетки [5].

По литературным данным установлена связь между EBV и TLR9 относительно инициации ряда аутоиммунных и онкологических нарушений. Доведена этиологическая роль EBV при ревматических заболеваниях, системной красной волчанке, васкулитах, неспецифическом язвенном колите и д.р. [1, 4]. В свою очередь, активация экспрессии TLR9 на эндотелиоцитах под влиянием молекул DAMP (damage-associated molecular patterns), образующихся вследствие любого повреждения ткани (ишемия, ожог, травма и др.), способствует пролиферации В-лимфоцитов, синтеза ими аутоантител с последующим формированием аутоиммунной органоспецифической (аутоиммунный гепатит и др.) и системной (СКВ, васкулиты) патологий.

Таким образом, исследование TLR-зависимого вирусного распознавания, в частности связанного с TLR9, является актуальным в плане возможного воздействия на механизмы регуляции иммунного ответа при EBV-инфекции с целью предотвращения формирования патологических нарушений, в т.ч. аутоиммунных или лимфопролиферативных.

Целью нашей работы было определение уровня экспрессии TLR9 на гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах у больных с хронической EBV-инфекцией в стадии репликативной активности вируса и латентной стадии.

Материалы и методы. Под нашим наблюдением находилось 40 человек в возрасте 18-74 лет, которым по данным анамнеза и результатам клинического, инструментального, лабораторного обследования, в том числе иммунологического, был установлен диагноз хронической EBV-инфекции.

На основании выявления специфических антител классов IgM и IgG к VCA EBV-антигенам, высоких титров антител класса IgG к EBNA EBV-антигенам и на фоне выявления ДНК вируса в биологических средах у 16 (40,0%) больных верифицирована хроническая EBV-инфекция в стадии репликативной активности вируса (1-я группа). Необходимо отметить, что в соответствующих больных ДНК EBV определяли: у четырех (25,0%) человек - в соскобах слизистых задней стенки глотки, у двух (12,5%) - в слюне и в 10 (62,5%) человек - одновременно в двух биологических средах (слюна + слизистая).

В остальных 24 (60,0%) пациентов на фоне выявления специфических антител к указанным выше антигенам EBV ДНК вируса обнаружено не было, что позволило верифицировать диагноз хронической EBV-инфекции в латентной стадии (2-я группа).

Исследование TLR9 проводили на основании выявления CD123⁺ на лейкоцитах периферической крови методом проточной цитофлюориметрии с использованием тест-систем фирмы «Bekton Dickenson» (США). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Statistika for Windows 6.0», используя критерий Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение.

У пациентов с хронической EBV-инфекцией в стадии репликативной активности вируса выявлены более высокие уровни экспрессии TLR9 на гранулоцитах, что в 3,8 раз больше (p<0,01), чем на моноцитах и 1,5 раза больше, чем на лимфоцитах (p<0,01).

У пациентов с хронической EBV-инфекцией в латентной стадии наблюдалось достоверно в 2,7 раза меньшее количество клеток с экспрессироваными TLR9 среди лимфоцитов (0,69±0,03%) по сравнению с лицами 1-й группы (1,88±0,01%). Что касается других клеток, то выявлена тенденция к уменьшению количества TLR9⁺-гранулоцитов (2,87±0,01%) и незначительная тенденция к увеличению TLR9⁺-моноцитов (0,80±0,09%) по сравнению с пациентами с хронической EBV-инфекцией в стадии репликативной активности вируса (соответственно 2,93±0,06%, 0,78±0,07%). Аналогично 1-й группе, у пациентов анализируемой группы уровень экспрессии TLR9 на гранулоцитах был достоверно в 3,6 раз выше, чем на лимфоцитах и в 4,2 раза выше, чем на моноцитах.

Таким образом, для хронической EBV-инфекции в разных стадиях активности вируса характерна более высокая экспрессия TLR9 на гранулоцитах по сравнению с моноцитами/лимфоцитами. У пациентов с хронической EBV-инфекцией в стадии репликативной активности вируса выявлено достоверно большее количество TLR9⁺-лимфоцитов, сравнительно с пациентами с латентной стадией EBV-инфекции, что возможно касается только EBV-инфицированных клеток, которые с помощью экспрессии данных рецепторов информируют другие клетки о своем статусе в качестве вирус инфицированных. Незначительная разница в изменении количества TLR9⁺-моноцитов/гранулоцитов в группах сравнения возможно указывает на более выраженное вовлечение в инфекционный процесс фагоцитирующих клеток, в т.ч. антигенпрезентирующих.

Литература:

1. Kawa K. Epstein-Barr virus-associated diseases in humans / K. Kawa // Inf. J. Hematol. – 2000. – V. 71. – P. 108-117.

2. Kawai T., Akira S. Innate immune recognition of viral infection // Nat. Immunol. – 2006. – Vol. 7, №2. – P. 131-137.

3. Kawai T., Akira S. The roles of TLRs, RLRs and NLRs in pathogen recognition // Internat. Immunol. – 2009. – Vol. 21, №4. – P. 317-337.

4. Kimberley J. Epstein-Barr virus DNA as a biomarker for Epstein-Barr virus-positive lymphomas: are we there yet? / J. Kimberley, Maher K. Gandhi den Kemia // Lymphoma. – 2009. – V. 50. – P. 684-686.

5. Krishnan J., Lee G., Choi S. Drugs Targeting Tool-like Receptors // Arch. Pharm. Res. – 2009. - Vol. 32, №11. – P. 1485-1502.

6. Yasuda K., Rutz M., Schlatter B., Metzger J., Luppa PB [et al.] CpG motifindependt activation of TLR9 upon endosomal translocation of “natural” phosphodiester DNA // Eur J Immunol. – 2006. - Vol. 36. – P. 431-436.