Лебедева Г. В., Проскуряков М.Т.

Кубанский Государственный Университет,

тел. (861) 266-52-26, E-mile:galinalebedeva@rambler.ru,

Адрес: г. Краснодар, Пашковский-1 350911 ул. Фадеева 29, кв 162

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПЛОДОВЫХ ТЕЛ ВЕШЕНКИ PLEUROTUS OSTREATUS.

.

Базидиальные грибы широко используются в пищу, в качестве лекарственных средств, а также как источник биологически активных соединений (1). В нашей работе предприняты шаги к выделению и характеристике молокосвертывающего фермента (или группы ферментов) из плодовых тел Вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.), получаемых в промышленных масштабах в нашей стране.

Материалом к данной работе послужили плодовые тела Вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.), приобретенные на местном рынке. Грибы гомогенизировали, замораживали, затем размораживали, отделяли экстракт, который хранили при –18⁰С. После получения грубого экстракта способом, описанным выше, оставшуюся грибную массу заливали раствором определенного рН в количестве 1: 1 по объему, выдерживали в течение двух часов при комнатной температуре; затем, после повторного экстрагирования, оценивали молокосвертывающую активность. Получили, что наиболее благоприятна дополнительная экстракция в диапазоне рН 6,5 – 7,5.

Общий белок определяли по Варбургу и Христиану (2). Молокосвертывающую активность (МСА) оценивали по модифицированной методике Пятницкого (3) и рассчитывали по следующей формуле: А=2 * (60/t). Общую протеолитическую активность определяли по методу Кунитца (4). Получили, что содержание белка в грубом экстракте (рН 6,88) составляет 15 мг/см³, а МСА 3,4 ед./см³. Для определения диапазонов рН активации и стабильности использовали универсальную буферную смесь (УБС) (5). К одному объему УБС с необходимым значением рН приливали один объем исследуемого образца, инкубировали смесь при 35⁰С; каждый час отбирали пробу и оценивали общую протеолитическую активность. рН измеряли в начале эксперимента и непосредственно при завершении. Автоактивация протеолитических ферментов заканчивалась через 2 часа при рН 6,01 и 6,84. Таким образом, выяснено, что для дальнейших исследований необходимо использовать экстракт после инкубации при 35 ⁰С в течение двух часов.

При ступенчатом фракционировании сульфатом аммония получили, что интересующая нас активность наблюдается от 30 % до 70% насыщения сульфатом аммония. Также провели эксперимент по осаждению фермента хлоридом натрия при полном насыщении при разных значениях рН. Экстракт доводили до необходимого значения рН (диапазон от рН 2,5 до рН 9,0), затем насыщали солью; раствор центрифугировали (15 минут при 6000), осадок отделяли и оценивали МСА в осадке и супернатанте. Получили три пика активности в осадках при рН 3,6, 4,5, 5,6. Наиболее приемлемыми условиями для осаждения хлоридом натрия признали рН 3,6

Таким образом, нами были установлены первые этапы выделения и очистки протеолитического фермента сычужного действия из плодовых тел Вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.).

Литература:

1. 1. Белова Н.В. Перспективы использования активных соединений высших базидиомицетов в России // Микология и фитопатология. – 2004. – вып. 2. – С. 1 –7.

2. Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот, К. Джонс. Справочник биохимика. М.: «Мир», - 1991. 544 с.

3. Пятницкий Н.П., Проскуряков М.Т. Определение активности химотрипсина по скорости створаживания молочно-ацетатной смеси // Материалы 17 научной конференции физиологов Юга России. РСФСР., Т.2, Ставрополь. – 1969, С 80-82

4. Нортроп Д., Кунитц М., Хэрриот Р. Кристаллические ферменты. М.: Изд-во иностранной литературы. – 1950. – 346 с.

5. Джорджеску П., Пуэнеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования.- Бухарест: Медицинское изд-во. – 1963, - 611 с.