Биологические науки / 5. Молекулярная  биология

М.А. Шиян

Киевский национальный университет им. Т.Г. Шевченко, Украина

Модель активации и функционирования MRN комплекса, основанная на взаимодействии с флуктуирующей ДНК

Введение. Генетический материал всех клеток эукариот постоянно подвергается действию эндогенных и экзогенных повреждающих агентов ДНК, в том числе ионизирующей радиации, свободных радикалов и генотоксичных химических соединений. Двуцепочечные разрывы (DSB – double strand break) также образуются в течение репликации ДНК или мейоза. Даже один двуцепочечный (DSB) разрыв может быть летальным. Оставленные неисправленными, DSB могут привести к хромосомной нестабильности, клеточной гибели, соматическим мутациям, перестройкам, генетическим мутациям и канцерогенезу. Именно поэтому исключительно необходимой для клетки является способность воспринимать разрыв, сигнализировать об этом повреждении и как можно быстрее отвечать адекватной биологической реакцией.

Обзор литературы. Современные структурные и биологические данные свидетельствуют, что MRN комплекс выполняет 3 родственные критические роли в восприятии, стабилизации, сигнализации, и образовании реакционной платформы (скефолда) при DSB:

1) быстрое установление нуклеопротеид связывающего скефолда для распознавания и стабилизации DSB;

2) начальные этапы узнавания DSB, сигнальные каскады контрольных точек клеточного цикла, установка эпигенетических меток с помощью АТМ кинази;

3) функционально регулирует ремоделирование хроматина поблизости DSB.

MRN комплекс функционирует в восприятии и передаче сигнала о DSB. Он также имеет значительную роль в главных путях репарации DSB – гомологической рекомбинации (HR) и негомологическом объединении концов ДНК (NHEJ).

MRN комплекс также необходим для сигнализации о контрольной точке клеточного цикла после DSB во время всех фаз развития клетки.

Также он играет важную роль в процессинге структур ДНК, которая возникает в течение нормальной S-фазы, задействованный в предупреждении ДНК ре-репликация и является необходимым для поддержки теломер.

MRN содержит 5 суперклассов ДНК-репарационных мотивов и доменов [1]:

1) домены узнавания повреждений ДНК;

2) домены взаимодействий протеин-протеин;

3) нуклеазные мотивы;

4) АТФ-зависимые конфирмационные переключатели;

5) АТФ-двигатель для раскрытия ДНК в разрывах (геликаза).

MRN комплекс рассматривают как ансамбль хемо-механичних аппаратов, так как составные протеины привносят энергию связывания и превращают химические модификации в конфирмационные изменения, что может быть описно в механических терминах. Фосфорилирование компонентов MRN комплекса достоверно внедряет другой уровень регуляции путем изменения взаимодействий и конфирмационных состояний. Согласно современным данным, общая концепция функционирования комплекса предусматривает, что нуклеотид- и ДНК-регулированая архитектура комплекса MRN частично кодируют то, каким образом индивидуальные этапы путей ответов на DSB совмещены друг с другом формируют гармоничную мозаику путей, которые слажено переплетаются. Структурно функциональные особенности комплекса выражают, что пространственная и временная регуляция репарации ДНК является эмерджентным свойством специфических явлений связывания и конфирмационных переключений.

Эти структурные связи минимизируют выход токсичных и мутагенных ДНК продуктов. Williams et al. (2007) предложил [2] рассматривать MRN скорее узел, который обеспечивает ответвление многочисленных путей, чем как отдельный компонент с линейным путем. Для сложных репарационных случаев, мультивалентность обусловлена объединением слабых связей вместе, что обеспечивает высокую специфичность, даже когда индивидуальные динамические поверхности (интерфейсы) низкоспецифичны. В практическом аспекте, эта концепция показывает, что одна или несколько таких составленных поверхностей MRN могут быть эффективно блокированы малыми ингибиторами, молекулами или же использоваться в качестве целей стратегий для генной терапии, направленных на нарушенные пути репарации. Такие новые антираковые терапевтические средства могут использоваться в качестве эффективных адъювантных агентов для сенсибилизации сильнопролиферирующих опухолевых клеток к химиотерапии и радиационным процедурам [2].

Значительная роль в этом процессе принадлежит Rad50, ибо его мутации высоколетальны, в то время как мутации других компонентов MRN комплекса являются распространенными синдромами заболеваний. Но и немногочисленные совместимые с жизнью мутации Rad50 значительно снижают жизнеспособность и повышают чувствительность к повреждающим ДНК агентам [3,4].

MRN комплекс также известен как Mre11 комплекс, или MRX у дрожжей. Это комплекс трех протеинов Mre11, Rad50 и Nbs1 (также известный как Nibrin или p95). Он необходим для поддержания жизнеспособности клеток позвоночных, но не дрожжевых. MRN комплекс задействован во всех случаях метаболизма ДНК, которые предусматривают DSB. Ортологи человеческого Rad50 и Mre11 были обнаружены во всех таксономических царствах, тогда как Nbs1, похоже, уникальный для эукариотных клеток, ведь ни одного ортолога не обнаружено в прокариотах и архебактериях. Хорошо охарактеризован дрожжевой гомолог MRN, MRX, который состоит из протеинов Mre11, Rad50 и Xrs2, последний показывает слабую гомологию с человеческим Nbs1 [5].

Mre11, Rad50 и Nbs1 имеют отличные роли в составе интактного MRN комплекса. Mre11 взаимодействует с Rad50 и с Nbs1, которые не контактируют направлению друг с другом. Rad50, родственный протеинам структурного поддержания хромосом (SMC), имеет два глобулярных домена, связанных длинным регионом структуры типа коилед-коил (биспираль), которая формирует вытянутые плечи. Биспиральный антипараллельный домен сформирован последовательными гептамерними повторами. На конце обоих плечей содержится крюк-домен, который позволяет молекулам Rad50, используя АТФ-связывающие кассеты (ABC) АТФазу, димеризоваться и связывать концы ДНК вместе. Также он помогает Mre11 в процессинге концов ДНК. Mre11 отвечает за связывание ДНК и также имеет обе экзо- и эндонуклеизные активности, охарактеризованные in vitro, а также способность к локальному расплетанию ДНК. Mre11 непосредственно объединяет Nbs1, ДНК и Rad50.

Наконец, Nbs1 (с неизвестной стехиометрией в составе комплекса), у которого нет известных энзиматических свойств, отвечает как за быструю релокализацию комплекса в большие фокальные структуры, так и за взаимодействия с другими протеинами, которые обеспечивают сигнализирование и репарацию DSB. Он обеспечивает регуляторные роли комплекса: имеет домены взаимодействия с BRCT, ATM и Mre11. Среди его партнеров есть ATM, γH2AX и Mdc1. Также было сообщено об участии карбокси-терминального участка Nbs1 в регуляции апоптоза вызванного радиацией.

Аминокислотная последовательность Rad50 и Mre11 высококонсервативна у эукариотов, эти протеины, как правило, существуют в виде гетеротетрамерного комплекса (R4m4). RM комплекс формирует вытянутую биполярную структуру, которая состоит из глобулярной головы и длинного хвоста структуры коилед-коил. Глобулярная голова состоит из Mre11 и Атфазного домена Rad50 [6].

Потеря функционирования любого из этих протеинов (Mre11, Rad50 и Nbs1) ведет к геномной нестабильности, главному признаку раковых клеток. Дефектное функционирование MRN было связано со многими типами рака, в том числе молочной железы, яичников, толстой кишки, желудка, простаты, а также с лейкемией и меланомой. Гипоморфные мутации в любом из человеческих генов MRN проявляются в склонности к раку, синдромах геномной нестабильности: мутации в генах Mre11 и Nbs1 вызывают соответственно атаксия телангиектазия-подобное расстройство (ATLD) и Nijmegen breaking синдром (NBS). Мутации Rad50 также были описаны недавно, однако до сих пор не обнаружено связанного с ними синдрома.

Симптомы MRN синдромов в значительной мере перекрываются и включают [7]: иммунодефицит и умственную отсталость, играют роль в возникновении и развитии рака крови, участвуют в переключении классов антител в зрелых В-клетках в ответ на антигенную стимуляцию и костимулирующими сигналами, обеспечивают путем уникального внутрихромосомного типа делеционной рекомбинации. В этих процессах промежуточными этапами выступают одно- и двуцепочечные разрывы. Для процессинга их путем рекомбинации концов ДНК необходим ряд протеинов DNA-PK, ATM, Mre11-Rad50-Nbs1, γH2AX, 53BP1, Mdc1, и XRCC4-лигаза IV [8].

Протеины Mre11–Rad50 (MR) закодированы в геномах бактериофагов, эубактерий, архебактерий и еукариотов. Комплекс способен связывать концы молекул ДНК, обладает рядом ДНК нуклеазных. геликазных, АТФазных, аденилаткиназных активностей и выполняет множество клеточных функций: мейотическая рекомбинация, репарация двуцепочечных разрывов, процессинг неправильно свернутых структур ДНК и поддержание длины теломер [9]. Специализированные теломерные протеины (например, шелтерины), протеины репарации ДНК, чекпоинтов, имеют двойственную роль в поддержании теломер и сигналлинге при повреждении ДНК. Все они защищают концы теломер от деградации и некотории из них также необходимы в рекрутирования теломеразы и других аспектах гомеостаза длины теломер [10].

Rad50 и MRN комплекс принадлежат к семейству АТФаз отвечающих за структурное поддержание хромосом(SMC). Они найдены во всех царствах, эволюционно высококонсервативны и могут рассматриваться как уникальные протеины-машины работающие на механистическом уровне. SMC протеины высоко динамичны и пластичны, вовлекают в свою работу многочисленные внутренние и межмолекулярные протеин-протеиновые взаимодействиях [11].

SMC протеины образуют V-образный димер, шарнирный домен этого комплекса играет критическую роль в модулировании механохимического цикла SMC протеинов. Инициирующее взаимодействие шарнирного домена с ДНК ведет к открытию плеч комплекса в результате запуска гидролиза АТФ-связанного с доменами головок, расположенных на расстоянии 50нм от шарнира. Соответственно SMC протеины обладают неотъемлемой способностью изменять свою конформацию в ответ на связывание с ДНК. Однако эта способность отлична от таковой для MRN комплекса, шарнирный крюк-домен которого совершенно другой природы и не характеризуется ДНК-связывающим свойством [12].

Связывание ДНК вызывает значительные конформационные перестройки в комплексе, результатом которых является параллельная ориентация биспиральных плеч. ДНК связывается и с Mre11 и Rad50, однако окончательно взаимная ориентация ДНК и этих двух протеинов не известна [13].

Для выполнения комплексом его функций, необходима целостность обоих компонентов, Mre11 и Rad50. Например, утрата нуклеазной активности Mre11 при сохранении других активностей и сохранении способности образования комплекса, нарушает клеточное выживание [14]. Показано, что Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) комплекс несет различные, однако химически родственные, АТФазную и аденилаткиназную каталитические активности [15]. Головка Rad50 несет АТФ-связывающий домен родственный таковому АВС транспортеров(CFTR и т.д.) [16]. Мутации консевативного сигнатурного мотива Rad50 значительно ослабляют аденилаткиназную активность, но не понижают АТФазную. Такие мутанты напоминают Rad50 нулевые штаммы по отношению к мейозу и поддержанию теломер у S. cerevisiae, указывая на корреляцию аденилаткиназной активности с in vivo функциями. Ингибиторы аденилаткиназной активности блокируют Mre11/Rad50-зависимые связывание ДНК in vitro и бесклеточных экстрактах, показывая что ДНК-ДНК ассоциация требует аденилаткиназную активность. Связывание ДНК комплексом стимулируется связыванием АТФ, а не гидролизом, так как негидролизируемые аналоги АТФ стимулируют связывание ДНК так же или более эффективно чем АТФ. In vivo, M/R/N(X) комплексы, весьма вероятно, задействованы во всех активностях ДНК – связывание, расплетание и сведение концов, – что вероятно координируется молекулами Rad50 в разном каталитическом состоянии [17].

MRN комплекс является наномашиной, высокочувствительной к DSB. В исследованиях Moreno-Herrero et al., (2005) [18] с использованием атомной силовой микроскопии человеческого Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) комплекса связанного с ДНК сообщалось о вызванном связыванием ДНК распространении конформационных изменений на дистальные концы биспиралей Rad50и выпрямлении скефолда в 1000 ангстрем с последующим бриджингом концов ДНК. Биспиральные участки Rad50 характеризуются значительной неравномерностью распространения гибкости по длине участков низкой сложности. В центре выступающих плеч Rad50 присутствуют два участка (разделенные 11нм) повышенной гибкости [19].

Непосредственно после индукции DSB, MRN релокализуется в сайты повреждения. Начальное рекрутирование обеспечивается концы-связывающей активностью комплекса, однако, позже избыток MRN рекрутируеться к прилегающим к DSB участкам в большие фокальные структуры. Фокальное накопление регулируется взаимодействиями с γH2AX, специфической для повреждений ДНК фосфоформой пистона H2AX. В течение начального рекрутирования, MRN защищает и связывает концы ДНК вместе за счет цинковых крюков на концах длинных гибких рук Rad50, с молекулами Mre11 звязуючими DSB. При связывании DSB, плечи Rad50 поддаются структурным изменениям, становятся жесткими и параллельными и создают мостик между обоими концами ДНК, используя цинковый крюк. Защищенные таким образом, могут состояться начальные этапы процессинга DSB. Дополнительно активируется сигнальный каскад, первым звеном которого является активация ATM киназы. Считается, что неактивные димеры ATM рекрутируются к Nbs1 в участках DSB, результатом чего есть автофосфорилирование и диссоциация ATM в виде активных мономеров ATM. ATM киназа далее фосфорилирует много протеинов, которые отвечают на повреждение ДНК, в том числе и сам Nbs1, в результате чего индуцируется сигнальный каскад ответа на повреждение ДНК.

Целый ряд протеинов ответа на повреждение ДНК также рекрутируются к сайтам повреждения и обеспечивают процессинг и репарацию DSB. ATM-зависимый сигнальный путь отвечает как за эффективную репарацию DSB, транскрипцию и апоптоз, как и за регуляцию временной задержки клеточного цикла, который, как считается, длится время, необходимое для репарации ДНК до момента прохождения ключевых стадий клеточного цикла.

Даная модель недавно была усложнена вследствие открытия участия поли(Адф-рибозил)полимеразы 1 (Parp1) в скорой релокализации Mre11 и Nbs1 в очаговые структуры в сайтах повреждения ДНК. Parp1 быстро активируется разрывами ДНК и сигнализирует о повреждении путем присоединения АДФ-рибозних единиц к ассоциированым с хроматином протеинам.

Haince et al. предложили [20], что Mre11 может направленно связываться с этими АДФ-рибозними единицами за счет короткого полиадф-рибоза (PAR) связующего мотива, локализованного между двумя ДНК-связующими участками, в противоположность ранним моделям, в которых Nbs1, но не Mre11, считался необходимым для локализации комплекса в местах повреждения. Однако, возможно, оба протеина необходимы для быстрого и эффективного накопления комплекса в местах повреждений. Parp1 может сотрудничать с MRN комплексом, облегчая передачу сигналу о DSB. Недавно обнаружена связь еще одного протеина с MRN – это CTIP (или Ctp1). Это опухолевый супрессор присутствует в ядре в течение S и G2 фаз клеточного цикла. Недавние исследования показали, что CTIP может формировать комплекс с MRN, направлению взаимодействуя из Nbs1 в зависимый от клеточного цикла способ. Формирование этого коплекса, который включает в себя также и Brca1, требует циклинзависимой киназной активности. Было показано, что этот Brca1-mrn-ctip комплекс является важным для процесса DSB резекции, причем генерируется 3’ выступающая цепь ДНК, необходимая для DSB репарации путем гомологической рекомбинации и для обеспечения сигнализирования контрольных точек. Много данных свидетельствуют о высоком разнообразии функций MRN комплекса, новые открытия непрерывно добавляют сложности к общей картине. Детальное механистическое понимание того, как реально MRN комплекс работает in vivo, остается отдаленным [20].

Главная функция хроматина – сжимать и компактизировать геномную ДНК для ее защиты от нуклеазы и для ее организации в функциональные компартменты. При стабильном поддержании такого конденсируемого состояния, такие процессы метаболизма ДНК, как транскрипция, репликация и ДНК репарация, не могут происходить через ограниченность в доступе любых энзиматических факторов к ДНК. Для преодоления этой преграды, структура хроматина динамически изменяется в течение клеточного цикла или дифференциации, такие же динамические изменения происходят и при ответе на повреждение ДНК. Изменения, которые ведут к структурным преобразованиям хроматина и позволяют осуществление репарационных и метаболических процессов, называются ремоделированием хроматина. Atm/rmn комплекс является особенно критическим в процессе ремоделирования хроматина в течение репарации DSB [6].

Прекрасный пример использования молекулярно-механистических знаний о комплексе на практике приведен в [21], где сообщно, что молекулярное нарушение Rad50 сенсибилизирует человеческие опухолевые клетки к основанной на цисплатине химиотерапии. Исходя из вышеописанных структурно-функциональных посылок, потеря цинкового крюка подавляет функционирование MRN. Вследствие этого предположили, что биспирильные полипептиды, которые содержат лишь CXXC мотив и способны димеризоватись друг с другом, могут экранировать открытые, связавшиеся с DSB комплексы. Создали вектор, экспресирующий мутантний Rad50 с цинковым крюком и прилежащими биспиральными участками, но без сайта взаимодействия с Mre11 и АТФазных доменов. Объединение протеинов комплекса не может координироваться вокруг мутантного белка, что вызывало доминантный негативный эффект, который нарушал MRN комплекс, наблюдалось значительное снижениее экспрессии протеинов комплекса [21].

Модель процесса. Нативная ДНК непрерывно колеблется, флуктуирует, что вызвано ее метаболической активностью, работой процессивного аппарата. Такие колебания, кинки (изгибы, петли), передаются через Н-связи окружающей структурированной водной оболочке. При наличии свободного конца ДНК (двунитевой разрыв), кинк стекает (передается) в окружающий раствор. MRN комплекс может воспринимать такие локальные возмущения через колебания Н-связей связанной воды ближней у ДНК и рекрутироватся к свободному концу DSB [22].

Связанный с концом ДНК комплекс подвергается действию кинка, флуктуирует. Такие колебания, в результате излучения напряжения с комплекса в окружающиую водную оболочку, заставляют комплекс перейти из замкнутой свободной конфомации в открытую, характеризующуюся жесткими, параллельными «плечами».

Описанная модель соответствует методологии концепции «белок-машина». Она отвечает на главный вопрос о природе изменения конформации биспиральных участков и объясняет, как сигнал ДНК-связывания передается на всю длину (50 нм) «плеч» комплекса, так как «плечи» обладают низкой сложностью low complexity coiled-coil и не могут передавать сигнал другими способами, кроме как механически. Вероятно, выпрямление плеч осуществляется благодаря изменению конформации участков повышенной гибкости в биспиральных плечах [19].

Такой особенный механизм функционирования комплекса, отличающийся от родственных SMC протеинов, связан с заменой постоянного глобулярного шарнирного домена на лабильный цинковый крюк Rad50. Этот крюк обеспечивает образование равновесной смеси свободных и димеризированых структур, характеризующуюся низкой энергией перехода из одного состояния в возбужденное, что может служить предпосылкой для высокой чувствительности системы к сигналам от DSB [13].

Непрерывное поддерживание «открытой» конформации комплекса требует выполнения работы, энергия для которой берется за счет кинков, так как активация комплекса не требует постоянного гидролиза АТФ. В рамках предложенной модели связывание таких макроэргов как АТФ или АДФ необходимо для перехода комплекса MRM из одного конформационного состояния в другое, но не как постоянный источник энергии. Также сохранение функций комплекса MRM наблюдается и при связывании негидролизируемых аналогов макроэргов [15].

Возможно, облегченное рассеивание кинка с помощью комплекса MRM вызывает изменения в напряжении прилежащих участков ДНК, что ведет к ремоделированию хроматина, рекрутинованию комплекса и других протеинов к месту повреждения.

Выводы. Предложенная модель позволит лучше понять функционирование ключевого комплекса обеспечивающего все взаимодействия с DSB в живой клетке. Может служить базой для разработки новых биофизических и иных подходов в терапии заболеваний, связанных с нарушением процессов репарации и раковых заболеваний [2].

Литература.

1. Rupnik A. Grenon M. The MRN complex // Current Biology. – 2008. – Vol.18, N11. – Р.455-457.

2. Williams R.S., Williams J.S., Tainer J.A. Mre11-Rad50-Nbs1 is a keystone complex connecting DNA repair machinery, doublestrand break signaling, and the chromatin template // Biochem. Cell Biol. – 2007. – V/85. – P.509–520.

3. de Jager M., Kanaar R. Genome instability and Rad50S: subtle yet severe // Genes Dev. – 2002. – V.16. – P.2173-2178.

4. Stracker T.H. et al. The Mre11 complex and the metabolism of chromosome breaks: the importance of communicating and holding things together // DNA Repair. – 2004. – V.3. – P.845–854.

5. Lavin M.F. et al. ATM and the Mre11 complex combine to recognize and signal DNA doublestrand breaks // Oncogene. – 2007. – V.26. – P.7749–7758.

6. Kenta IIJIMA et al. 2008. Dancing on Damaged Chromatin: Functions of ATM and the RAD50/MRE11/NBS1 Complex in Cellular Responses to DNA Damage // J. Radiat. Res. – 2008. – V.49. – P.451-464.

7. Chen L., Nievera C., Lee A.Y., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1/CtIP/MRN is important for DNA double-strand break repair // J. Biol. Chem. – 2008. – V.283. – P.7713–7720.

8. Stavnezer J. et al. Mechanism and Regulation of Class Switch Recombination // Ann. Rev. Immunol. – 2008. – V.26. – P.261–292.

9. Connelly J.C., Leach D.R.F. Tethering on the brink: the evolutionarily conserved Mre11–Rad50 complex // Trends in Biochemical Sciences. – 2002. –V.27, N.8. – P.410-418.

10. Grandin N., Charbonneau M. Protection against chromosome degradation at the telomeres // Biochimie. – 2008. – V.90. – P.41-59.

11. Hirano T. et al. SMC proteins and chromosome mechanics: from bacteria to humans // Phil. Trans. R. Soc. B. – 2005. – V.360. P.507–514.

12. Hirano1 M., Hirano T. Opening Closed Arms: Long-Distance Activation of SMC ATPase by Hinge-DNA Interactions // Molecular Cell. – 2006. – V.21. – P.175–186.

13. Kanaar R., Wyman C. DNA Repair by the MRN Complex:Break It to Make It // Cell. – 2008. – V.135. – P. 14-16.

14. Williams R. S. et al. Mre11 Dimers Coordinate DNA End Bridging and Nuclease Processing in Double-Strand-Break Repair // Cell. – 2008. – V.135. P.97-109.

15. Williams R. S., Tainer J. A. Learning Our ABCs: Rad50 Directs MRN Repair Functions via Adenylate Kinase Activity from the Conserved ATP Binding Cassette // Molecular Cell. – 2007. V.25. – P. 789-791.

16. Moncalian G. et al. The Rad50 Signature Motif: Essential to ATP Binding and Biological Function // J. Mol. Biol. – 2004. – V.335. – P.937–951.

17. Bhaskara V. et al. Rad50 Adenylate Kinase Activity Regulates DNA Tethering by Mre11/Rad50 Complexes // Molecular Cell. – 2007. – V.25. – P.647-661.

18. Moreno-Herrero et al. A Nanomachine for Making Ends Meet: MRN Is a Flexing Scaffold for the Repair of DNA Double-Strand Breaks // Molecular Cell. – 2005. – V.19. – P. 724-726.

19. van Noort J. et al. The coiled-coil of the human Rad50 DNA repair protein contains specific segments of increased flexibility // PNAS. – 2003. – V.100,N13. – P.7581–7586.

20. Haince J.F. et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites // J. Biol. Chem. – 2008. V.283. – P.1197–1208.

21. Abuzeid W.M. et al. Molecular disruption of RAD50 sensitizes human tumor cells to cisplatin-based chemotherapy // The Journal of Clinical Investigation. – 2009. – V.119, N.7. – P.974-1985.

22. Neidle S. Nucleic Acid Structure and Recognition. – Oxford: Oxford University Press, 2002. – P.252.