ПОИСК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИММУНОСТИМУЛЯТОРОВ СРЕДИ ЗАМЕЩЕННЫХ МОНО- И БИЦИКЛИЧЕCКИХ ПИПЕРИДИНОВ

к.б.н.*Бактыбаева Л.К., д.б.н.*Тулеуханов С.Т., д.х.н.**Ю В.К.

*Биологический факультет Казахского национального университета им.аль-Фараби, **Институт химических наук им. А.Б.Бектурова МОН РК

Средства, стимулирующие (нормализующие) иммунные реакции, используют в комплексной терапии иммунодефицитных состояний, хронических инфекций, злокачественных опухолей. В качестве иммуностимуляторов применяют биогенные вещества (препараты тимуса, интерферонов, интерлейкин-2, БЦЖ) и синтетические соединения (например, левамизол). На сегодняшний день различают иммуностимуляторы микробного, тимического, костно-мозгового, цитокинового, из нуклеиновых кислот, растительного и синтетического происхождения. Препараты природного происхождения отличаются трудностью в биологической стандартизации, недоступностью ингредиентов (например: лейкинферон производят in vitro при индукции лейкомассы здоровых доноров вакцинным штаммом вируса болезни Ньюкасла), очень часто препараты отличаются высокой стоимостью, при применении требуется длительное и системное применение, кроме того, из-за того, что препараты производят из биологического материала, они, как правило, очень часто вызывают аллергические реакции и другие побочные эффекты. В отличие от них препараты синтетического происхождения более доступны по цене, легко и быстро стандартизируются, и для многих препаратов бывает достаточно однократного приема.

На сегодняшний день наиболее широко применяемым синтетическим препаратом является левамизол (декарис) [1]. Он обладает выраженным иммуностимулирующим эффектом. Левамизол оказывает действие на макрофаги и Т-лимфоциты. Продукцию антител он не изменяет [2]. Следовательно, основной эффект левамизола проявляется в нормализации клеточного иммунитета. Назначают левамизол в комбинации со специфическими действующими препаратами. Препарат предназначен для введения внутрь. При однократном приеме побочных эффектов практически не наблюдается. Вместе с тем при повторных введениях левамизола, особенно если дозы велики, возникают различные побочные проявления, в том числе достаточно серьезные. Так, возможны выраженные аллергические реакции (сыпь, лихорадка, стоматит), угнетение кроветворения (нейтропения, агранулоцитоз). Кроме того, отмечаются неврологические нарушения (возбуждение, бессоница, головная боль, головокружение) и диспепсические явления (тошнота, рвота, диарея). В связи с возможным угнетением кроветворения при многократном введении левамизола необходим контроль картины периферической крови. Также среди синтетических соединений наиболее новыми и эффективными являются препараты полиоксидоний и иммунофан. Исследование их фармакологической активности проводится и по сегодняшний день. Таким образом, в виду скудности выбора иммуностимуляторов поиск новых эффективных и безопасных препаратов является актуальной задачей.

Цель настоящей работы заключается в биологическом скрининге трех соединений, относящихся к классу моно- и бициклического пиперидина, для определения фармакологического потенциала указанного класса стимулировать иммунную систему. На сравнительный анализ в данную статью были взяты соединения, проявившие наиболее высокую активность. Соединения испытаны в виде комплексов с β-циклодекстрином под лабораторными шифрами БИВ:

^.С₄₂Н₇₀О₃₅

БИВ-1 [3]

БИВ-2 [4]

БИВ-7 [5]

Материалы и методы

Материалом служили белые половозрелые беспородные крысы массой 210-260 г, обоего пола, 80 особей и половозрелые мыши массой 18-23 г, обоего пола, 80 особей. Иммунодепрессивный синдром у крыс и мышей вызывали путем отравления ацетатом свинца в дозе 10 мг/кг веса животного. Соль свинца растворяли в дистиллированной воде и вводили перорально в течение 10 дней: мышам 1 мл/сут, крысам 10 мл/сут. Животные содержались в стандартных условиях вивария с одинаковым пищевым рационом. Исследования проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием лабораторных животных». Исследуемые соединения вводили на физиологическом растворе внутримышечно в объеме 0,5 мл. в течение 10 дней. Крыс поделили на 5 групп: 1, 2, 3, 4-ой группам вводили исследуемые соединения в дозе ЕД₅₀(БИВ-1)=8,5 мг/кг; ЕД₅₀(БИВ-2)=7,9 мг/кг; ЕД₅₀(БИВ-7)=8,0 мг/кг, ЕД₅₀(левамизол)=0,4 мг/кг, 5-ой группе физиологический раствор (плацебо), и последняя группа (6-ая) животных была интактная. Забор крови у крыс проводили на 10-ый день лечения путем цервикальной дислокации спинного мозга в шейном отделе. Контроль за состоянием животных проводили визуально (по состоянию покровов, активности, сохранению инстинктов и т.д.), иммунную оценку состояния крови оценивали с помощью следующих методик: забор периферической крови осуществляли из хвостовой вены животных с 1-го дня введения соединений и последующие 3, 6, 10, 20, 30 сутки наблюдения. Из крови делали мазки для подсчета лейкограммы крови. Мазки крови окрашивали по Романовскому-Гимза, подсчитывали на микроскопе SA3300С под иммерсией (увеличение 7х100) по 100 клеток на каждом мазке[4].С помощью камеры Горяева по общепринятой методике определяли общий лейкоцитарный показатель. Кроме того, забор периферической крови проводили из орбитального синуса крыс на 1, 10, 30 сутки наблюдения. Животных наркотизировали эфирным наркозом, проводили забор крови в объеме 1, 5 мл и немедленно гепаринизировали 25 ЕД/мл. С целью получения лимфоцитарно – моноцитарной клеточной суспензии гепаринизированную кровь разводили физиологическим раствором (1:2) и наслаивали на градиент фиколла – верографина (1,5 мл фиколла на 3 мл разведенной крови), а затем центрифугировали в течение 30 мин при 1500 об/мин. Далее на лимфоцитарно – моноцитарном слое проводили оценку субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови методом типирования мембранных молекул с помощью моноклональных антител ИКО 111(СД3), ИКО 101(СД4), ИКО 31(СД8), ИКО 180(СД20), ИКО 105(СД25) (НПЦ «МедБиоСпектр», Москва) [4]. Результаты реакции СД – типирования оценивали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ при увеличении 10х90. Методом бластной трансформации [5,6] и НСТ-реакции [7] оценивали врожденную резистентность. При статистической обработке результатов исследований проводили сравнение выборок по критерию t Стьюдента.

Влияние соединений БИВ на костно-мозговое кроветворение исследовалось на мышах [8] с искусственно вызванным иммунодепрессивным синдромом. Мышей забивали на 6, 10, 12, 14, 21, 28 сутки после начала лечения. Костный мозг из бедренных костей использовали для приготовления мазков. Мазки костного мозга окрашивали по Романовскому-Гимза, подсчитывали миелограмму, затем относительное количество каждого типа клеток костного мозга пересчитывали в абсолютное на 1 бедренную кость.

Острую токсичность новых соединений определяли при внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам обоего пола и массой 18-23 г.

Биологическая активность и острая токсичность новых соединений сопоставлялись с данными эталонного препарата: левамизола.

Результаты и обсуждение

В результате подсчета общего лейкоцитарного показателя и лейкоцитарной формулы периферической крови крыс были получены следующие данные (табл. 1). В результате 10-дневной интоксикации организма солью свинца у животных произошло достоверное снижение общего лейкоцитарного показателя по сравнению с интактными крысами в 4,8 раза. Произошел сдвиг лейкоцитарной формулы влево: выход несозревших гранулоцитарных лейкоцитов в периферическую кровь, резкое увеличение количества палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, снижение показателя лимфоцитов. Нейтрофилы характеризовались гиперсегментированностью ядер и токсической зернистостью. Эритроциты также были базофильно зернисты. Таким образом, после 10-дневной интоксикации у крыс развился приобретенный иммунодепрессивный синдром, который выражался в лейкопении на фоне нейтрофилеза и лимфопении. Данные показатели наблюдались на протяжении последующих двух – трех недель, в течении которых погибли все не леченные контрольные животные. Проведенное лечение новыми синтетическими соединениями ряда БИВ и препаратом сравнения левамизолом дало следующие результаты. Соединение БИВ-7 проявило самую высокую иммуностимулирующую активность. Оно повышало общий лейкоцитарный показатель в 1,9 раза по сравнению с животными, которым вводили физиологический раствор (плацебо) и было эффективнее левамизола, соединений БИВ-2 и БИВ-1 в 1,5; 3,6 и 1,4 раза соответственно. В периферической крови достоверно снизилось количество миелоцитов и палочкоядерных нейтрофилов, лимфоцитарный показатель увеличился по сравнению с контрольными крысами в 2,8 и с животными, пролеченных левамизолом, в 1,1 раза. Количество лимфоцитов было даже выше, чем у интактных крыс. Показатели эозинофилов, базофилов и моноцитов повысились, вернувшись к нормальным показателям. Уступало по иммуностимулирующей активности соединению БИВ-7, но было сопоставимо с показателями препарата сравнения соединение БИВ-1. Оно повысило общий лейкоцитарный показатель по сравнению с плацебо в 1,4 раза. Аналогично соединению БИВ-7 БИВ-1 вернул показатели лейкоцитарной формулы к нормальным: снизилось количество миелоцитов, метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови. Количество лимфоцитов увеличилось в 2,5 раза по сравнению с плацебо и превышало лимфоцитарный показатель у крыс, леченных левамизолом. Также аналогично соединению БИВ-7

Таблица 1.

Картина лейкоцитарной формулы в периферической крови крыс после проведенного 10-дневного лечения

исследуемыми соединениями и левамизолом

Показатели крови

Шифр соединения

Общий лейко-цитарный показатель

миелоциты

мета-миелоциты

нейтрофилы

эозино-филы

базофилы

лимфо-циты

моноциты

палочко-ядерные

сегменто-ядерные

БИВ-1

2625,00±91, 55

52,5±1,5

2,8±0,3

105,7±1,21

4,0±0,1

420,0±6,2

16,2±0,3

1260,0±3,0

48,7±1,5

26,3±0,3

1,8±0,1

26,3±0,1

1,3±0,5

708,75±4,9

27,3±0,7

26,3±0,3

1,9±0,1

БИВ-2

1820,00±32, 94

18,2±0,2

1,2±0,2

54,6±1,9

3,2±0,5

327,6±1,8

18,0±0,9

946,4±1,8

52,6±1,7

36,4±0,6

2,8±0,2

36,4±0,3

2,2±0,08

364,0±1,5

20,4±0,5

36,4±0,6

2,8±0,2

БИВ-7

3583,33±32,92

35,83±0,3

1,0±0,1

71,66±1,4

2,5±0,2

429,96±3,2

12,6±0,8

1827,33±2,4

51,6±1,2

35,83±0,3

1,7±0,1

1110,7±9,9

31,1±0,3

71,66±1,4

2,5±0,2

левамизол

2366, 67

±51,63

47,3±0,8

2,8±0,2

118,3±3,3

5,9±0,3

425,88±4,0

18,1±0,9

993,72±10,2

42,5±1,3

47,3±0,4

2,4±0,1

23,7±0,3

1,0±0,01

686,14±3,0

29,2±0,5

23,7±2,3

1,7±0,1

плацебо

1900,0

±51,24

95.7±0,21

5,3±0,2

133,0±2,71

7,0±0,1

266,0±2,48

14,1±0,1

1140,7±3,2

60,9±0,6

38,3±0,5

2,0±0,1

19,5±0,3

1,8±0,2

209,5±1,2

11,0±0,9

интактные

9182,2

±12,24

477,5±2,7

5,2±0,3

5692,96±71,2

62,0±0,1

376,5±5,2

4,1±0,9

165,3±6,3

1,8±0,1

2020,4±61

22,0±1,9

560,1±4,2

6,1±0,5

Примечание: числитель – общее количество клеток в 1 мкл. крови.

знаменатель – относительное содержание клеток в %.

соединение БИВ-1 активно повышало количество лимфоцитов и превышало данный показатель здоровых крыс, но в пределах нормы. Очень низкую иммуностимулирующую активность проявило соединение БИВ-2. После проведенной 10-дневной терапии общий лейкоцитарный показатель был сопоставим с таковым у крыс, пролеченных плацебо, хотя в лейкоцитарной формуле снизилось количество несозревших полинуклеаров и количество лимфоцитов приблизилось к нормальным показателям. Таким образом, среди исследуемых химических веществ соединение БИВ-7 обладает самой высокой иммуностимулирующей активностью среди тестируемых соединений. Оно увеличивало по сравнению с контролем количество лейкоцитов практически в 2 раза и возвращало сдвиг лейкоцитарной формулы в норму, что выражалось в нормализации скорости созревания гранулоцитарных и агранулоцитарных лейкоцитов и выхода в периферическую кровь.

Для оценки влияния соединений БИВ на клеточный и гуморальный иммунитет были проведены следующие реакции по подсчету количественных показателей активных, Т-, В-лимфоцитов и их субпопуляций (табл.2). У крыс, отравленных солью свинца общее количество лимфоцитов упало в 2 раза, количество В-лимфоцитов, Т-хелперов упало в 1,4 раза, количество активных лимфоцитов и Т-супрессоров/киллеров упало в 1,25 раза. После проведенного лечения исследуемыми соединениями и левамизолом самым высоким лимфоцитостимулирующим действием обладало соединение БИВ-7. Общее количество лимфоцитов увеличилось по сравнению с плацебо и стандартным препаратом в 5,3 и 1,6 раза соответственно. Соединение БИВ-7 проявило отчетливо высокую активность в отношении Т-лимфоцитов и его субпопуляций. Их количество увеличилось по сравнению с животными, пролеченными плацебо и препаратом сравнения, в 1,9 и 1,6 раза соответственно. Естественно, что произошли изменения в количественных показателях Т-хелперов/индукторов и Т-киллеров/супрессоров. Количество СД4⁺ Т-клеток увеличилось по сравнению с плацебо и препаратом сравнения в 2,4 и 1,6 раза соответственно. Данный показатель даже превосходил таковой интактных крыс, что, по-видимому, связано с активной стимуляцией соединением пролиферативного пула Т-клеток. Также увеличивалось количество СД8⁺ Т-клеток. По сравнению с животными, пролеченных физиологическим раствором и препаратом сравнения, в 3,6 и 2,1 раза соответственно. Интересно, что количество Т-киллеров/супрессоров было выше, чем у здоровых крыс в 2,9, но в пределах нормы. Если учесть, что до лечения у больных животных количество Т-лимфоцитов и его субпопуляций упало в 1,8 раза и резко возросло, после проведенного лечения соединением БИВ-7, практически в 3 раза и превзошло таковой показатель у здоровых крыс, то можно предположить, что соединение БИВ-7 сильный иммуностимулятор Т-клеточного пула. Уступающую соединению БИВ-7 и сопоставимую со стандартным препаратом иммуностимулирующую активность проявило соединение БИВ-1. Оно увеличивало количество лимфоцитов по сравнению с контролем в 3,4 раза, количество активных лимфоцитов в 1,8 раза и количество Т-лимфоцитов в 1,2 раза. Процентный показатель всех субпопуляций лимфоцитов превышал таковой у интактных крыс и был сопоставим с активностью левамизола. В отношении В-лимфоцитарного пула соединение БИВ-1 повышало количество В-клеток по сравнению с плацебо в 1,5 раза и было сопоставимо с левамизолом.

Уступало всем исследуемым соединенным и препарату сравнения в иммуностимулирующей активности соединение БИВ-2. Оно незначительно повышало количество лимфоцитов и практически не влияло на число активных Т- и В-лимфоцитов.

Таблица 2.

Содержание лейкоцитов, лимфоцитов и иммуноцитов в периферической крови крыс в норме, после проведенного 10 - дневного лечения исследуемыми соединениями и левамизолом

Показатели

крови

Шифр

соединений

лейкоциты

лимфоциты

ИКО 105(СД25)

ИКО 111(СД3)

ИКО 180(СД20)

ИКО 101(СД4)

ИКО 31(СД8)

БИВ – 1

2625, 00

±91,55

708,75±6,6

27,1±3,3

113,28±1,78

16,2±0,22

219,48±5,64

31,1±1,23

113,6±7,3

16,9±0,71

45,99±1,2

21,0±0,35

32,85±0,21

15,3±0,7

БИВ – 2

1820,00

±32,94

364,0±2,4

20,1±1,8

32,76±2,9

9,1±0,20

91,6±4,6

25,1±1,1

40,04±0,08

11,1±0,21

14,4±0,6

16,5±0,32

16,38±1,2

18,7±0,24

БИВ – 7

3583,33

±32,92

1110,73±23,7

31,2±1,93

122,21±6,7

11,3±0,91

544,39±6,4

49,6±1,64

66,6±0,12

6,3±0,27

195,84±1,8

36,4±0,33

114,24±5,4

21,4±0,51

левамизол

2366,67

±51,63

686,14±4,2

29,3±0,8

178,36±1,24

26,2±2,2

205,8±3,78

30,7±1,93

144,06±2,70

21,8±0,8

47,15±0,81

23,3±0,4

20,5±2,8

10,1±0,61

интактные

9182,20

±12,24

2020,04±20,4

22,0±1,9

204,02±4,25

10,1±0,2

929,2±18,3

46,3±2,5

319,97±3,2

15,84±1,58

195,09±2,4

21,3±0,34

69,68±0,9

7,5±0,16

плацебо

1900,00

±51,24

209,5±1,2

11,0±0,9

19,32±0,83

9,19±0,13

54,97±0,32

26,3±0,35

24,61±1,2

11,72±0,48

14,75±0,89

15,21±0,21

5,82±0,85

6,0±0,26

Примечание: числитель – общее количество клеток в 1 мкл. крови

знаменатель – относительное содержание клеток в %.

Для оценки влияния исследуемых синтетических соединений БИВ на фагоцитарную активность полинуклеаров был проведен НСТ-тест (спонтанный). Результаты приведены в таблице 3. В результате 10-дневного отравления солью свинца НСТ показатель упал с 5-10% до 1 %. После 10-дневной терапии самую высокую активность проявило соединение БИВ-7, которое превосходило стандартный препарат в 2 раза и почти достигло НСТ показателя здоровых крыс. На уровне левамизола проявило активность соединение БИВ-2.

Таблица 3.

Показатели НСТ-теста и реакции бласттрансформации лимфоцитов

Шифр соединения	НСТ – показатель, %	Процент образования бластов, %
БИВ-1	1	10
БИВ-2	2	21
БИВ-7	3-4	42
левамизол	2	43
плацебо	1	5
интактные	5-10	81, 5

Большой интерес представляет при лечении лейкопении и других иммунодепрессивных синдромов иммуностимулирующими препаратами способность препаратов стимулировать лимфоциты к бласттрансфорации. Результаты проведенного исследования приведены в таблице 3. У контрольных животных, пролеченных физиологическим раствором после интоксикации их организма солью свинца, наблюдалось почти полное отсутствие реакции бластообразования (до 5%). Соединение БИВ-7 проявляет сопоставимую с эталонным препаратом активность. Все остальные препараты уступали эталонному препарату.

ось ординат – сутки наблюдения

ось абцисс – количество клеток х 10 ⁹

Рисунок - Общее количество миелокариоцитов (А), лимфоцитов (Б), нейтрофильных лейкоцитов (В) и эритроидных клеток (Г) в костном мозге мышей после проведенного лечения соединениями ряда БИВ и левамизолом.

Для оценки влияния соединений БИВ на пролиферативную активность клеток костного мозга подсчитывали количество миелокариоцитов, сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов, эритроидных клеток и лимфоцитов в костном мозге на 6, 10 день лечения и на 2 сутки (12 сутки опыта), 4 сутки (14 сутки опыта), 11 сутки (21 сутки опыта), 18 сутки наблюдения (28 сутки опыта). Результаты опыта приведены на гистограммах. Нарастание количественного показателя миелокариоцитов шло наиболее интенсивно под влиянием соединения БИВ-7, который превосходил левамизол и остальные соединения БИВ. Кроме того, его показатели, начиная с 6-го дня наблюдения, превосходили показатели интактных крыс. Количество сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов также наиболее интенсивно нарастало под влиянием соединения БИВ-7 и на 12-ые сутки наблюдения превысило показатели левамизола, соединений БИВ и контроль (норму). Нарастание лимфоцитарного показателя наблюдалось с 14-го дня наблюдения и превышало данный показатель интактных крыс, пролеченных стандартным препаратом и соединениями БИВ. Исключением по скорости пролиферации клеток костного мозга после интоксикации организма солью тяжелого металла были эритроидные клетки.

После 10-дневной интоксикации организма количество эритроидных клеток приблизилось к критическому показателю и после проведенного лечения соединениями БИВ-7 и БИВ-1 с 6-ых суток наблюдения планомерно повышалось и на 28-ые сутки наблюдения почти достигло нормального уровня.

Таблица 4.

Острая токсичность соединений

Шифр соединения	ЛД₅₀, мг / кг	Показатель острой токсичности относительно левамизола
Левамизол	47, 24 ± 0, 71	1
БИВ – 1	851, 138 ± 1, 38	18, 0
БИВ – 2	787, 045 ± 8, 38	16, 7
БИВ – 7	790, 678 ± 8, 74	16, 7

В целом все соединения исследуемого ряда проявили очень низкий показатель острой токсичности (табл.4) . Острая токсичность трех соединений БИВ-1, БИВ-2, БИВ-7 лежала в диапазоне от 790 до 851 мг/кг массы тела животного, что характеризовало соединения как малотоксичные. Показатель острой токсичности соединений был менее токсичным в 16-18 раз, чем у левамизола.

Таким образом, резюмируя все вышеизложенные данные лабораторных испытаний по скринингу соединений БИВ на иммуностимулирующую активность, можно отметить, что БИВ-7 является активным иммуностимулятором Т-клеточного пула, фагоцитарной активности полинуклеаров, превосходя препарат сравнения в 2-3 раза при более низком уровне острой токсичности. Следующим по активности стоит соединение БИВ-1, стимулирующее деление В- и Т- лимфоцитов, проявляя аналогичную левамизолу активность и обладает низким уровнем острой токсичности.

Литература:

1. Машковский М.Д., Лекарственные средства. /М., 1986, часть 2, с. 169-171.

2. Харкевич Д. А. Фармакология. Учебник для вузов. /М.: ГЭОТАР – МЕД, 2002.

3. Предпатент РК 16429. Ю В.К., Кабдраисова А.Ж., Пралиев К.Д., Фомичева Е.Е., Шин С.Н., Бекетов К.М. 1-(2-Этоксиэтил)-4-(2-метоксиэтоксил)-4-этинилпиперидин и его комплекс с β-циклодекстрином, обладающие анальгетической активностью. Опубл. 15.11.2005, бюл. 11.

4. Предпатент РК 16428. Пралиев К.Д., Кабдраисова А.Ж., Фомичева Е.Е., Ю В.К., Шин С.Н., Бекетов К.М. 1-(2-Этоксиэтил)-4-(2-этоксиэтоксил)-4-этинилпиперидин и его комплекс с β-циклодекстрином, обладающие анальгетической активностью. Опубл. 15.11.2005, бюл. 11.

5. Редькин Ю. В., Соколова Г. Ф., Зубахин А. А. Способ выделения клеток крови для одновременной постановки реакций торможения миграции лейкоцитов, розеткообразования и бластной трансформации. //Лабораторное дело, 1982, №2, С. 110-111.

6. Адонкин Ф. С., Тарасюк И. В. Способ определения В – лимфоцитов крыс. //Здравоохранение Белоруссии, 1992, №10, С. 44.

7. Тотолян А. А. и другие. Метод постановки НСТ – теста. //Лабораторное дело, 1987, №11, С. 863 – 866.

8. Пашкевич И. А., Успенская Ю. А., Нефедова В. В., Егорова А. Б. Анализ ядрышкового аппарата клеток костного мозга при свинцовой интоксикации.//Гигиена и санитария, 1997, №4, С. 15-18.