К.б.н. Бактыбаева Л.К., Даутова М.Б, Карбаева А.С.

Казахский национальный университет имени аль-Фараби, Казахстан

Разработка новых миелостимуляторов

В настоящее время в медицинской клинической практике используют препараты с миелосупрессивным действием. Но выбор эффективных миелостимулирующих препаратов, способных за короткий промежуток времени восстановить показатели периферической крови и миелограммы костного мозга, очень ограничен. Кроме того, миелостимуляторы находят широкое применение в офтальмологии, хирургии, косметологии и в биотехнологии. Таким образом, фармакологический скрининг миелостимулирующих препаратов актуален на сегодняшний день.

Методы. В работе использовали здоровых половозрелых животных - лабораторных крыс обоего пола, 10-15 нед. возраста, массой тела 210-280 г. До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в одинаковых стандартных условиях, на стандартном рационе, по 6 особей в клетке. Забор крови проводили из орбитальной вены крыс, наркотизированных слабым эфирным наркозом в 09.00 часов утра. Анализ крови проводили на гематологическом анализаторе для лабораторных животных «Abacus junior vet» (пр-во Diatron, Дания). Миелосупрессию вызывали внутримышечным введением цитостатика циклофосфамида натрия в дозе 30 мг/кг веса животного. Опытным группам животных соединения вводили в дозе 10 мг/мл (растворитель физиологический раствор), внутримышечно в объеме 0,5 мл ежедневно в течение 3 дней, спустя 3 дня после последнего введения определяли количество клеток в периферической крови. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили физиологический раствор. Препаратом сравнения являлся пантогематоген.

Результаты. Контрольные значения, полученные от интактных животных поступивших на эксперимент были в пределах физиологической нормы. Лейкоцитарный показатель (9,1±2,51)·10⁹/L крови, с лимфоцитарным (5,46±1,1)·10⁹/L крови , что составляло (60,9±0,9)%. Гранулоцитарные лейкоциты имели значение (3,64±0,9)·10⁹/L крови с процентным соотношением в лейкограмме (40,0±0,4)%. Минимальным был моноцитарный показатель (05,0±0,0)10⁹/L крови, что по лейкограмме составило (6,0±0,7)%. Также показатели эритроцитов и тромбоцитов были в норме. Эритроцитарный показатель составил (6,5±1,4)·10¹²/L крови с содержанием гемоглобина (140,7±1,2) г/L крови и соответственно гематокрита (39,8±1,9)% . Лишь тромбоцитарный показатель был несколько сниженный (350,6±3,6)·10⁹/L крови, также как и тромбокрит составлял лишь (12,6±0,3)%. Но в целом основные показатели крови, поступивших на эксперимент животных, были в норме. Направленное иммунодепрессивное действие введенного циклофосфамида натрия привело к миелодепрессивному синдрому с падением показателей крови уже на 1-ые сутки после введения. Общий лейкоцитарный показатель составил (4,15±1,2)·10⁹/L крови, т.е. со снижением в 2,19 раза (p≤0,05) и на 3-и сутки после введения уровень лейкоцитов составил (2,69±0,54)·10⁹/L крови, что составило 3,40-кратное падение по сравнению с контролем(p≤0,01). По лейкограмме крови можно отметить значительные отрицательные изменения клеточных пулах лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов. Показатели иммунокомпетентных клеток-лимфоцитов с контрольного значения (5,46±1,1)·10⁹/L крови снизились на 1-ые сутки до (2,46±0,75)·10⁹/L крови и достигли на 3-и сутки уже (1,99±0,18)·10⁹/L крови, т.е. в 2,74 раза (р≤0,05). Еще более значимые изменения произошли в клеточных популяциях гранулоцитов. Уровень гранулоцитарных лейкоцитов со значения (3,64±0,9)·10⁹/L крови снизился к 1-му дню до (1,33±0,18)·10⁹/L крови, т.е. в 5,28 раз (р≤0,01). В процентном соотношении столь резкого снижения не было зафиксировано. Уменьшение гранулоцитов составило на 3-и сутки после введения циклофосфамида (23,75±8,55)%, т.е. в 1,68 раза. Значительное снижение абсолютного показателя гранулоцитов в 5,28 раза по сравнению с умеренным уменьшением относительного показателя гранулоцитарных лейкоцитов в 1,68 раза можно объяснить и значительным падением общего лейкоцитарного показателя, что отразилось на абсолютных показателях клеток в крови.

Некоторое увеличение моноцитов наблюдалось на 1-ые сутки после введения циклофосфамида, что можно объяснить массовой гибелью клеток и увеличением функциональной нагрузки. Показатель интактных животных (6,0±0,7)% к 1-му дню после введения циклофосфамида стал (7,05±4,6)% , но уже на 3-и сутки после введения он упал до (0,6±0,0)% , т.е. в 10 раз от контрольного значения (р≤0,01).

В красных кровяных клетках столь значимых изменений как в лейкоцитарных клеточных популяциях не наблюдалось. Некоторые колебания эритроцитраных клеток от (6,5±1,4)·10¹²/L крови со снижением на 1-ые сутки до (4,71±1,37)·10¹²/L в 1,38 раза и незначительным повышением до (5,80±0,27)·10¹²/L на третьи сутки после введения циклофосфомида. Также тенденция в колебаниях показателей на 1-ые сутки и 3-и сутки после введения циклофосфамида натрия наблюдалась в значениях гемоглобина, гематокрита, среднего объема эритроцитов, среднего содержания гемоглобина в эритроцитарных клетках, широте распределения эритроцитов. Снижение показателей наблюдалось на 1-ые сутки в 1,2-1,6 раза с дальнейшим повышением значений. Значимые изменения были зарегистрированы в показателях тромбоцитов, что естественно отразилось на значениях тромбокрита, среднего объема тромбоцитов и широты распределения тромбоцитов. Уже на 1-ые сутки после введения циклофосфомида натрия уровень тромбоцитов упал до (345,0±126,0)·10⁹/L крови при контрольном значении (500,0±147,0)·10⁹/L крови, т.е. в 1,45(р≤0,05). К 3-им суткам после введения уровень тромбоцитов снизился до (74,5±39,5)·10⁹/L крови от контрольного значения (500,0±147,0)·10⁹/L крови, т.е. в 6,71 раза (р≤0,01). Данный показатель считается критическим и характеризуется спонтанными внутриполостными кровотечениями и другими гемофилитическими нарушениями.

Таким образом, можно сделать заключение о том, что циклофосфамид вызвал миелосупрессию и наиболее чувствительными клетками являлись лейкоцитарные клетки и тромбоциты. Среди лейкоцитарных клеток в первую очередь погибали лимфоциты, гранулоциты и далее моноциты. Далее на фоне миелодепрессивного синдрома животным вводили азогетероциклические соединения под шифром «К». Среди всех соединений высокую активность проявили соединения К-68, К-69, К-70, К-71. Они стимулировали пролиферативную активность клеточных пулов костного мозга и стимулировали выброс клеток из периферических лимфомиелоидных органов. Среди данных соединений наиболее высокую активность проявило соединение К-69. В группе животных с введением соединения К-69 уже на 6-е сутки после первого введения соединения абсолютный лейкоцитарный показатель составил (6,51±0,4)·10⁹/L крови, против контрольного значения (2,79±0,92)·10⁹/L крови, что составило 2,33-кратную разницу (р≤0,05). По абсолютным клеточным показателям лидировало соединение К-69. В данной группе животных лимфоцитарный показатель составил (3,53±0,12)·10⁹/L крови против контрольного значения (1,55±0,88)·10⁹/L крови, т.е. с превышением в 2,28 раза (р≤0,05). Уровень моноцитов в абсолютном значении составил (0,32±0,2)·10⁹/L крови против контрольного значения (0,12±0,1)·10⁹/L крови. Лучшие значения были также в отношении гранулоцитарных лейкоцитов, составляя (2,65±0,06)·10⁹/L крови против контрольного значения 1,13±0,14·10⁹/L, с превышением в 2,35 раза (р≤0,05). Но относительные значения К-69 , несмотря на высокие абсолютные значения, были ниже, чем в группе введения соединения К-68. Максимальное значение лимфоцитов было в группе введения соединения К-68 составляя (68,0±0,8)%, превышая относительные значения лимфоцитов в группах введения соединений К-71 (65,0±3,3)% , К-70 со значением (56,9±0,4)% и К-69 со значением (54,3±1,8)% и с контрольным значением (50,65±14,65)%. Но как видно из представленных значений особо значимых различий в показаниях не наблюдалось, поэтому стоит обратить внимание на абсолютные значения лимфоцитов с акцентом на соединение К-69. Остальные относительные показатели гранулоцитарных лейкоцитов, моноцитов прямо коррелировали с абсолютными значениями. Максимальные значения абсолютного показателя гранулоцитарных лейкоцитов активного соединения К-69 составил (2,65±0,06)·10⁹/L крови против контрольного значения (1,13±0,14)·10⁹/L крови, превышая в 2,35 раза (р≤0,05). Коррелирование абсолютного значения с относительным показателем крови выражался в показателе гранулоцитов (40,8±0,9)% против контрольного значения (33,35±9,35)% и против значений в группах введения соединений К-69 (29,5±3,1)% и соединения К-71 (29,97±1,04)%. Также значения моноцитов в группе введения соединения К-69 составило максимальное значение в исследовательских группах и составило (0,32±0,2)·10⁹/L крови, соединения К-70 (0,02±0,0)·10⁹/L крови, соединения К-70 (0,16±0,1)·10⁹/L крови против контрольного значения (0,12±0,1)·10⁹/L крови. Относительное значение моноцитов также было максимальным у животных с введением соединения К-69, составляя (4,9±2,8)% против значений в группах введения соединения К-68, К-70 и К-71 следующих: (2,4±1,2)%, (0,7±0,0)% и (4,03±3,31)% соответственно (таблица 1).

Таблица 1 – Показатели гемограммы периферической крови

Шифр соединения	Общий лейкоцитарный показатель (WBC, ·10^9/L)	Абс. кол-во гранулоцитов ___(*10^9/L)___ отн. кол-во гранулоцитов ( %)	Абс. кол-во лимфоцитов ___(*10^9/L)___ отн. кол-во лимфоцитов ( %)	Абс. кол-во моноцитов ___(*10^9/L)___ отн. кол-во моноцитов ( %)
К-68	3,0±0,06	0,88±0,04 29,5±3,1	2,04±0,06 68,0±0,8	0,07±0,04 2,4±1,2
К-69	6,51±0,0	2,65±0,06 40,8±0,9	3,53±0,12 54,3±1,8	0,32±0,2 4,9±2,8
К-70	3,52±0,02	1,49±0,02 42,4±0,36	1,67±0,33 56,9±0,4	0,02±0,0 0,7±0
К-71	3,28±0,03	0,98±0,04 29,97±1,0	2,13±0,13 65,0±3,3	0,16±0,1 5,03±3,31
Контроль	2,785±0,92	1,125±0,135 43,35±9,35	1,545±0,875 50,65±14,65	0,115±0,095 6,0±5,3
Иммун/депр3 сут.	2,675±0,535	0,685±0,355 23,75±8,55	1,985±0,175 75,65±8,55	0,015±0,005 0,6±0,0
Интактные	9,1±2,51	3,64±0,9 40,0±1,4	5,46±1,1 60,0±0,7	0,5±0,0 6,0±0,4

Соединения К-69 также стимулировало пролиферативную активность красных клеток крови: эритроцитов и тромбоцитов. Эритроцитарный показатель на 6-ой день после первичного введения соединения К-69 составил (6,52±0,0)·10¹²/L крови, превышая контрольное значение (5,67±2,58)·10¹²/L крови и показателей в группах введения соединений К-68, К-70, К-71, составляя (3,24±0,03)·10¹²/L крови, (4,43±0,02)·10¹²/L крови и (4,9±0,06)·10¹²/L крови соответственно. Все значения в группах введения соединении К-68, К-70, К-71 уступали значению К-69 в 2,01; 1,47; 1,33 раза соответственно. Содержание гемоглобина в группе введения К-69 составило 110±0,5г/L крови, что превышало значение в группах введения соединений К-68, К-70, К-71 в 1,87; 1,35 и 1,21 раза соответственно, составляя (58,7±0,4)г/L; (81,6±0,5)г/L и (91,0±0,7)г/L крови. Аналогичная картина наблюдалась и по другим эритроцитарным показателям: гематокриту, среднему объему эритроцитов, средней концентрации гемоглобина в эритроцитарных клетках и широте распределения эритроцитов. Лидирующие показатели фиксировались в группе животных с введением соединения К-69, уступало К-70, далее шло К-71 и последнее место занимало К-68.

В отношении тромбоцитов можно сделать заключение, что соединение К-69 стимулировало и деление тромбоцитарных клеток. Уровень тромбоцитов достиг к 6-му дню наблюдения значения (509,0±1,0)·10⁹/L крови против контрольного значения (44,0±0,5)·10⁹/L крови и против в группах введения соединений К-68, К-70, К-71 следующих значений (232,3±3,77)·10⁹/L крови (342,0±6,7)·10⁹/L крови соответственно.

Несомненно, что соединения К-69 является лидирующим в отношении миелостимулирующих свойств.

Литература:

1. Алмазов В. А., Афанасьев Б. В., Зарицкий А. Ю., Шишков А. Л. Лейкопении. — Л.: Медицина, 1981. — 240 с.

2. Кинетические аспекты гемопоэза/Под ред. Г. И. Козинца, Е. Д. Гольдберга. — Томск, 1982. — 311 с.

3. Гершанович М. Л. Осложнения при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. Злокач. новообразования. — М., 1982. — 223 с.

4. Adams J. A., Barrett A. J. Haematopoietic stimulators in the serum of patients with severe aplastic anaemia. — Brit. J. Haemat., 1982, vol. 52, N 2, p. 327 — 335.

5. Anderson M. J. The emerging story of a human parvovirus-like agent. — J. Hyg. Camp., 1982, vol. 89, p. 1 — 10.

6. Dessypris E. N., McKee G. L., Metzontonakis C. et al. Ptire red cell aplasia associated with chronic granulocytic leukemia. — Brit. J Haemat. 1981 vol 48, N 2, p. 217 — 225.

7. Ding Xun-Jie, Li Yuan, Ding Yur. Chromosome changes in patients with chronic beuzeae poisoning. — Chinese med. J., 1983, vol. 96, N 9, p. 681 — 685.

8. Ershler W. B., Ross J., Finlay L., Shahidi N. T. Bone Marrow microenvironment defect in congenital hypoplastic anemia. — New Engl J. Med 1980 vol. 302, p. 1321 — 1327.

9. Kanamaru А., Наrа H., Nagai K. Hemopoietic stem cells and their regulatory factors in aplastic anemia. — Acta Haemat. Jap., 1981, vol 44. N7 n 1332 — 1340.

10. Khelif A., Vuvan H., Tremisi J. P. et al. Remission of acquired pure red cell aplasia following plasma exchanges. — Scand. J. Haemat., 1985, N 34, p. 13 — 15.

11. O′Brien H., Amess J. A., Mollin D. L. Reccurent thrombocytopenia, erythroid hypoplasia and sideroblastic anaemia associated with hypothermia. — Brit. J. Haemat., 1982, vol. 51, p. 451 — 456.

12. Otsuca Y., Nino Y., Goto I. et al. A case of aplastic anemia following viral hepatitis B. — J. Kyu Hem. Soc., 1984, vol. 32, N 1 — 2, p. 38 — 41.