Сіренко О.В., Кучеренко Е.О., Мохамед А.М., Кабардинська Н.Д.

Кафедра клінічної лабораторної діагностики Харківської медичної академії післядипломної освіти   

Дослідження стану білків клітинної мембрани при тривалому впливі субтоксичних доз багатокомпонентних органічних сумішей

      Однією з рис сучасності є значне навантаження навколишнього середовища великою кількістю хімічних сполук, які синтезуються та використовуються як у побуті, так і у народному господарстві, у тому числі, багатокомпонентні органічні суміші на основі гліколів (БКОС). У цьому аспекті здатність гомеостатичних механізмів організму адаптуватися до змін навколишнього та внутрішнього середовищ має велике значення для збереження оптимального стану здоров’я великих контингентів населення [1]. Принциповим і необхідним елементом адаптації до впливу екзогенних шкідливих чинників є властивість клітини повертатися до фізіологічного стану, яка у значній мірі залежить від структурної та функціональної повноцінності клітинної мембрани [2].

         За даними сучасної літератури, інформативним методом, який дозволяє оцінити вплив ксенобіотику на структуру цитоплазматичної мембрани, є дослідження щільності її білково-ліпідного шару, побудованого з полярних ліпідів та білків [3].  Також вони є специфічними рецепторами для зв’язування різних регуляторів, вірусів, антитіл, у тому числі, гаптенів, до яких відносяться і ксенобіотики [3].

Наявність та ступінь пошкодження білкових структур цитоплазматичної мембрани впливають на інтенсивність фосфоресцентного світіння зразків біоматеріалу на різних хвилях збудження. Інтенсифікація фосфоресценції виникає внаслідок утворення білкових молекул у триплетному стані, наприклад – триптофану і тирозину сироватки крові, які висвітлюють фотон енергії при падінні збудження у відсутність світла оптичного діапазону. Цілісні мембрани відрізняються від пошкоджених значно нижчими рівнями фосфоресценції [2].

Метою роботи було дослідження стану білків клітинних мембран білих щурів при дії субтоксичних доз БКОС.

Матеріали та методи.  Эксперимент проведено на 95 щурах обох статей  популяції Вістар, масою 180±10г, яким протягом 45 діб щоденно внутрішньошлунково уводили 0,184 г/кг охолоджувальної рідини (ОР-40); 0,191 г/кг (ОР-65); 0,116 г/кг гальмівної рідини «Роса» (ГР); 0,117 г/кг гідравлічної рідини (ГдР), що дорівнює 1/100 LD50 цих сумішей. Контрольну групу склали інтактні тварини, які отримували 2 мл води на добу. Кров для аналізу брали з хвостової вени, після чого отримували сироватку. Дослідження виконано з урахуванням етичних вимог до експериментів з хребетними тваринами [4]. Перекисне окиснення білків та їх окислювальну модифікацію оцінювали за інтенсивністю фосфоресценції мембран і рівнях утворення 2-4-дінітрофенілальдо- та кетогідразонів [5, 6]. В експерименті оцінювали фотолюмінесценцію сироватки крові за інтенсивністю фосфоресценції, для чого зразки опромінювали ультрафіолетом, а після припинення дії збуджуючого світла реєстрували фосфоресценцію. Основу люмінометру для вимірювання фосфоресценції складав фосфороскоп, який забезпечував розподіл у часі процесів опромінення зразків збуджуючим світлом і реєстрацію показників в умовах абсолютного світлозахисту фотоприймальника від дифракції [7]. 

Статистичну обробку отриманих даних проводили з використанням програми Statistica 4.5, результати визначали у вигляді середніх арифметичних та їх стандартних помилок, вірогідність різниці між величинами, що порівнювали, визначали за t-критерієм Стьюдента.

Результати та обговорення. Метод фосфоресценції, результати якого добре співвідносяться з результатами електронного парамагнітного резонансу, дозволяє оцінити окислювальну модифікацію білків з високою точністю. Молекули білків розташовані або на поверхні, або у товщі гідрофобного шару мембрани, а однією з особливостей мембранних білків є підвищений вміст гідрофобних кінцівок амінокислот у порівнянні з гідрофільними. Відомо, що активні форми кисню (АФК) здатні впливати не тільки на ліпідні, а й на білкові компоненти мембрани, що може суттєво змінити структуру і функцію клітини, враховуючи, що більшість мембранних білків у разі пошкодження ліпідів втрачають ферментативну активність [2]. Крім того, функціональна активність мембран визначається співвідношенням катаболічних і анаболічних процесів інтегративних білків, їх необхідною конформацією та розташуванням у відповідній послідовності, що забезпечує оптимальне протікання метаболічних реакцій. У цьому аспекті можна припустити, що підвищення кількості перекисів та гідроперекисів, пов’язане із тривалим впливом БКОС, може впливати на процеси окислювальної модифікації білків цитоплазматичної мембрани. Таке припущення добре співвідноситься з отриманими результатами дослідження фосфоресценції сироватки крові щурів, які отримували субтоксичні дози органічних сумішей (табл.1).    

                                                                                                                     Таблиця 1

Динаміка фосфоресценції сироватки крові щурів, що отримували 1/100 LD50  БКОС, (M±m), (імп/с).

Спектри збудження (λ)

Контроль

Органічні суміші

ГдР

ГР

ОР-40

ОР-65

297

4248,6±68,7

4508,5±62,3*

4397,5±63,5*

4462,7±64,9*

4423,6±63,8*

313

3248,5±27,8

3858,9±40,7*

3579,9±31,6*

3704,6±33,2*

4228,2±36,7*

334

618,9±20,3

809,7±21,7*

786,8±19,7*

821,4±26,2*

846,3±26,4*

365

1889,5±39,4

2009,6±32,0*

2115,7±25,3*

2124,6±29,4*

2217,3±29,5*

404

459,7±17,9

627,5±17,8*

609,4±18,3*

658,3±23,7*

661,8±24,3*

434

609,6±14,8

827,5±21,3*

779,0±17,6*

836,8±16,3*

859,3±18,6*

Примітка: * - різниця показників вірогідна, (р<0,05).                                                                                                   

    Отримані дані свідчили про значне підвищення інтенсивності світіння сироватки крові, найбільш виражене під впливом коротких (λ = 297-334) і довгих (λ = 434) хвиль збудження. Результати реєстрації фосфоресценції можуть свідчити про конформаційні зміни білкових молекул, наслідком яких є втрата гнучкості структури ферменту, що негативно впливає на здатність зв’язуватися з лігандом, порушення структури і функції клітини, виникнення дистрофічних змін і гіпоксії [3]. Для уточнення даних щодо стимуляції окислювальної модифікації білків клітинної мембрани при дії субтоксичних доз БКОС досліджували рівні 2,4-дінітрофенілальдо- та 2,4-дінітрофенілкетогідразонів, вміст яких у сироватці крові щурів віддзеркалює інтенсивність катаболічних процесів (табл. 2).                                                                                                          

                                                                                                                    Таблиця 2

Динаміка окислювальної модифікації білків під впливом 1/100 LD50  БКОС,  (M±m), (імп/с).

Речовини

                                   Показники, (сироватка крові).

2,4-дінітрофенілальдогідразо

ни (од. опт. густини/г білку, λ – 370 нм)

2,4-дінітрофенілкетогідразо

ни (од. опт. густини/г білку, λ – 380 нм)

Контроль

21,73±1,82

24,55±2,18

ГР

38,95±2,25*

43,76±1,54*

ГдР

39,41±2,17*

42,54±2,12*

ОР-40

39,82±2,19*

39,60±2,11*

ОР-65

39,94±2,21*        

43,48±2,23*

Примітка: * - розходження показників статистично вірогідні, (р<0,05).

Визначене в усіх випадках підвищення рівнів 2,4 - дінітрофенілальдогідразонів та 2,4 – дінітрофенілкетогідразонів підтверджувало інтенсифікацію окислювальної модифікації білків клітинної мембрани, та  характеризувало спроможність БКОС активізувати катаболічні процеси. Можна припустити, що тривалий вплив досліджуваних речовин, навіть у субтоксичних дозах, здатний порушувати структурно-функціональні властивості клітинної мембрани, внаслідок чого можуть виникати зміни внутрішньоклітинного метаболізму, дисбаланс катаболічних і анаболічних процесів та зміни функції мембранних білків [6]. Вплив БКОС на основі гліколів на системи мембранного транспорту може набувати вирішального значення для виживання клітин в умовах хімічного стресу.

         Таким чином, 1/100 LD50  БКОС при надходженні до організму щурів стимулювала підвищення рівнів 2,4 - дінітрофенілальдогідразонів, 2,4 – дінітрофенілкетогідразонів, показників флюоресценції, (особливо коротко- та довгохвильового спектру), що співвідноситься з інтенсифікацією окислювальної модифікації білків клітинної мембрани.         Перспективою подальшого пошуку у даному напрямку є визначення полярності, текучості мембран, занурення білків у ліпідний шар, що дасть змогу уточнення порушень як структури, так і функції клітинної мембрани під впливом субтоксичних доз органічних сумішей на основі гліколів.

 

Література

1.Рахманин Ю.А., Литвинов Н.Н. Научные основы диагностики донозологических нарушений гомеостаза при хронических химических нагрузках // Гигиена и санитария. – М.:Медицина. - №6. – 2004. – С. 48 – 50.

2.Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки./ Руководство для врачей. Пер. с англ., М.: Бином-Пресс, 2003. – 272 с.

3.Баглей Е.А., Недопитанская Н.Н. Свободнорадикальные механизмы токсического действия химических веществ. Канцерогенез //Тези доп. І з’їзду токсикологів України /Під ред. Проданчука М.Г. – Київ, 2001. – С.50.

4.Загальні етичні принципи експериментів на тваринах //Ендокринологія. – 2003. – Т.8. - №1. – С. 142-145.

5.Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации. Под ред.проф. В.Х.Хавинсона. – СПб: ИПК «Фолиант», 2000. – 104 с.

6.Дубинина Э.Э., Бурмистрова Р.О., Хадиев Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белка. Методы ее определения // Вопросы мед.химии. - 1996. - Т. 41, Вып.1. - С. 24-26.

7. Пат. 52464А UA, МПК7G01N21/76. Пристрій для хемілюмінесцентних досліджень / Ф.А.Колодуб, В.М.Абашин; Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я.Данілевського АМН України. - №2002064693; Заяв.на 07.06.2002; Опубл. 16.12.2002, Бюл. №12. – С.3.