Сіренко О.В.

Кафедра клінічної лабораторної діагностики Харківської медичної академії післядипломної освіти

Використання методу біохемілюмінесценції для оцінки стану цитоплазматичних мембран

Актуальною проблемою сучасної профілактичної медицини є попередження розвитку екологічно обумовлених захворювань, які виникають внаслідок впливу на здоров’я людини великої кількості шкідливих факторів навколишнього та виробничого середовищ. У цьому аспекті важливе своєчасне визначення  відхилень у стані здоров’я населення, у тому числі, розробка методів їх донозологічної діагностики  [1]. Відомо, що в основі виникнення багатьох патологічних процесів лежать порушення мембрани та зміни внутрішньоклітинного метаболізму під впливом агресивних хімічних речовин. Цитоплазматичні мембрани відповідають не тільки за регуляцію транспорту речовин, а й за підтримку міжклітинних контактів шляхом активації рецепторів та специфічних ділянок ідентифікації. Визначення структурно-функціонального стану клітинної мембрани є важливим компонентом прогнозування донозологічних порушень здоров’я, що виникають внаслідок дії ксенобіотиків [2].

Ліпіди формують у мембрані два фосфоліпідних монослої, де полярні голівки молекул спрямовані у зовнішньо- та внутрішньоклітинне середовище, а гідрофобні вуглеводородні ланцюги розташовані у мембранному бішарі. Ліпіди цитоплазматичних мембран розподіляються асиметрично - нейтральні молекулами розташовані в основному у зовнішньому моношарі, а негативно заряджені - у внутрішньому шарі мембрани [2]. До цього ж, обидва моношари мембрани вміщують холестерин, який регулює упаковку, динамічність ліпідних молекул, текучість ліпідного бішару.  Зміни структурних компонентів цитоплазматичних мембран можуть обумовлювати виникнення сигналу для  функціональної перебудови клітини [3].

Деякі з ксенобіотиків сприяють підвищенню проникливості мембран при дії активних форм кисню для Са2+ та зниженню електричного потенціалу пробою, внаслідок чого знижується мікров’язкість ліпідної фази, що супроводжується структурними ушкодженнями клітинної мембрани та порушенням її оптимальної фізіологічної функції [2].

На теперішній час залишається невивченою дія на клітинні мембрани багатокомпонентних органічних сумішей, синтезованих на основі гліколів (БКОС) різних марок, що широко використовуються у народному господарстві та побуті. Відомо, що оптимальному рівню інтенсивності метаболізму відповідає конкретна інтенсивність спонтанного світіння біологічних субстратів, яка обумовлена вільнорадикальним окисненням ліпідних компонентів клітинних мембран, тому інформативним методом, який дозволяє оцінити стан білково-ліпідного шару цитоплазматичних мембран, є реєстрація біохемілюмінесценції (БХЛ). Здатність до найбільш вираженого світіння належить ліпідам, при цьому для кожного органу або тканини є свої специфічні рівні світіння, що змінюються під впливом різноманітних ксенобіотиків, у разі виникнення структурно-метаболічних порушень клітинної мембрани [3].  Хемілюмінесценція гомогенатів тканин з високою точністю віддзеркалює стан ліпідного шару клітинної мембрани, що обумовило доцільність використання даного біофізичного методу для оцінки стану цитоплазматичних мембран.

Метою дослідження було визначення впливу субтоксичних доз БКОС на стан цитоплазматичних мембран методом БХЛ.

Матеріали та методи.  Эксперимент проведено на 95 щурах популяції Вістар обох статей, масою 180±10г, яким протягом 45 діб щоденно внутрішньошлунково уводили 0,184 г/кг охолоджувальної рідини (ОР-40);  0,191г/кг охолоджувальної рідини (ОР-65); 0,160 г/кг гальмівної рідини «Роса» (ГР); 0,117 г/кг маси тіла гідравлічної рідини (ГдР), що дорівнює 1/100 LD50 цих сумішей. Дослідження виконувалися відповідно загальних етичних вимог до експериментів з хребетними тваринами [4]. Контрольну групу склали інтактні щури, які отримували 2 мл води на добу. Наприкінці експерименту щурів забивали методом цервікальної дислокації під легким ефірним наркозом. Для аналізу використовували сироватку крові, гомогенати печінки та нирок. Органи гомогенізували у ручному гомогенізаторі, після чого екстрагували ліпіди [5]. Показники структурно-функціонального стану цитоплазматичних мембран гомогенатів тканин щурів, що отримували органічні суміші, оцінювали по інтенсивності спонтанної та індукованої Н2О2 та FeCl3 , люмінолзалежної БХЛ. Зразки біологічного матеріалу термостатували у темновій камері при 37ºС, після чого виміряли власну інтенсивність світіння сироватки крові і гомогенатів, та індуковану, реєструючи спалахи світіння і кінетику реакції протягом 1,5-3 хвилин. Дослідження виконували на медичному біохемілюміномітрі БХЛМЦ 1-01. Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп’ютері з використанням пакету прикладних програм «Microsoft Excel». Вірогідність різниці у порівнянні з контрольною групою оцінювали з використанням t –критерію Стьюдента.

         Результати та їх обговорення. Аналіз модифікації структурно-функціонального стану плазматичної мембрани клітин під впливом органічних сумішей може сприяти більш глибокому розумінню ролі цих змін у регуляції адаптації клітин до стресових факторів хімічного навантаження. Динаміка спонтанної, індукованої та люмінолзалежної БХЛ свідчила про підвищення інтенсивності світіння сироватки крові та гомогенатів органів щурів, що отримували органічні суміші (табл.1).

                                                                                                                       Таблиця 1.

Динаміка БХЛ сироватки крові та гомогенатів органів щурів, що одержували органічні речовини у 1/100 LD50 (M±m), (І0 – імп/с),

Вид БХЛ

Речовини

Контроль

ГдР

ГР “Роса”

ОР-40

ОР-65

Сироватка крові

СХЛ

123,5±7,2

257,4±17,1*

248,8±16,8*

219,6±13.2*

261,3±18.2*

ІХЛ (Н2О2)

129,5±14,9

1631,2±27,2*

1321,4±18,3*

1379,5±17,9*

1472,6±18,7*

ІХЛ (FeCL3)

653,6±11,9

1574,3±30,4*

1279,3±26,4*

1334,8±16,8*

1474,3±19,5*

Люмінолзалежна ІХЛ (Н2О2)

1791,2±17,3

4451,3±49,5*

3862,7±39,8*

3864,7±41,5*

4364,5±43,5*

Люмінолзалежна ІХЛ (FeCL3)

1618,4±23,7

4149,8±47,3*

3648,8±31,3*

3721,5±32,6*

4427,8±36,4*

Гомогенати печінки

СХЛ

143,2±7,9

293,8±10,9*

265,8±12,1*

274,2±14,1*

286,4±13,8*

ІХЛ (Н2О2)

798,9±12,1

1499,8±15,7*

1184,9±17,9*

1237,2±18,9*

1427,8±17,9*

ІХЛ (FeCL3)

795,5±14,9

1507,8±22,6*

1379,3±20,4*

1319,7±20,4*

1512,6±21,5*

Люмінолзалежна ІХЛ (Н2О2)

1823,6±16,8

3918,4±23,5*

3875,9±27,4*

3896,5±24,3*

3844,5±24,2*

Люмінолзалежна ІХЛ (FeCL3)

1746,8±20,5

3846,7±26,5*

3759,4±27,1*

3826,5±26,98*

3895,6±26,8*

Гомогенати нирок

СХЛ

148,9±6,9

316,7±21,3*

288,6±18.4*

303,5±20,6*

321,4±21,6*

ІХЛ (Н2О2)

858,7±10,94

1582,5±19,1*

1367,5±17,4*

1488,7±18,9*

1522,8±19,3*

ІХЛ (FeCL3)

809,6±9,8

1513,4±20,8*

1416,4±18,6*

1475,9±19,7*

1519,4±20,2*

Люмінолзалежна ІХЛ (Н2О2)

1868,7±21,5

4253,6±63,7*

3821,9±54,5*

4011,8±55,3*

4326,2±59,4*

Люмінолзалежна ІХЛ (FeCL3)

1757,8±29,6

4146,4±57,8*

3936,4±51,7*

3775,4±49,8*

4206,9±52,4*

 

Примітка: * - різниця показників вірогідна, (р<0,05).

         Найбільш виражені відхилення від показників контрольних груп зареєстровані під час оцінки інтенсивності люмінолзалежної хемілюмінесценції сироватки крові (2030 – 2660 імп/с). Динаміка БХЛ дозволяє припустити здатність БКОС ініціювати вільнорадикальні процеси та збільшувати у тканинах рівні активних форм кисню, що може руйнувати білково-ліпідний шар цитоплазматичної мембрани. Активація перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) може призвести до виникнення структурно-метаболічних порушень клітинної мембрани та функції клітини [6].

Досліджувані органічні суміші у 1/100 LD50  викликали інтенсифікацію БХЛ біологічних субстратів, що дозволяє припустити збільшення рівнів збуджених електронних станів, активізацію процесів ПОЛ та пошкодження ліпідів  цитоплазматичної мембрани. Посилення вільнорадикальних процесів відзначають при багаточисельних інтоксикаціях, дії фізичних і біологічних шкідливих чинників і відносять до загальних неспецифічних реакцій організму на пошкоджуючий вплив [6]. Активація вільнорадикальних процесів і ПОЛ є універсальним механізмом пошкодження мембран, який реєструють при різних патологічних станах, дії стрес-факторів різної природи, старінні. Продукти ВРО і ПОЛ через вплив на мембрани змінюють в’язкість ліпідного біслою, призводять до появи продуктів, які гасять флуоресценцію, зменшують електричну стабільність, гідрофобний об’єм і порушують іонну проникливість мембран [7]. Отримані дані підтверджують, що вплив субтоксичних доз складних органічних сумішей стимулює вільнорадикальні механізми і процеси ПОЛ, що супроводжується появою АФК і накопленням в організмі гідроперекисів, вільних радикалів, які виснажують антиоксидантну систему, наслідком чого можуть стати деструктивні зміни цитоплазматичної мембрани. Підвищення показників люмінолзалежної БХЛ підтверджує ланцюговий вільнорадикальний характер змін окислювальних процесів в організмі щурів при дії субтоксичних доз БКОС.

Література.

1.Рахманин Ю.А., Литвинов Н.Н. Научные основы диагностики донозологических нарушений гомеостаза при хронических химических нагрузках // Гигиена и санитария. – М.:Медицина. - №6. – 2004. – С. 48 – 50.

2.Баглей Е.А., Недопитанская Н.Н. Свободнорадикальные механизмы токсического действия химических веществ. Канцерогенез //Тези доп. І з’їзду токсикологів України /Під ред. Проданчука М.Г. – Київ, 2001. – С.50.

3.Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. / Руководство для врачей. Пер. с англ., М.: Бином-Пресс, 2003. – 272 с.

4.Загальні етичні принципи експериментів на тваринах //Ендокринологія. – 2003. – Т.8. - №1. – С. 142-145.

5.Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации. Под ред.проф. В.Х.Хавинсона. – СПб: ИПК «Фолиант», 2000. – 104 с.

6.Бондаренко Л.А., Кучеренко В.П., Брянцев О.Н., Шевченко В.Г. Оценка состояния здоровья рабочих химического производства с помощью хемилюминесцентных методов исследования водоемов //Матер. ХIV съезда гигиенистов Украины: Гигиеническая наука и практика на рубеже столетий. – 19-21 мая 2004. – Днепропетровск. – Т.2. – С. 163-165.

7.Закурдаев В. В. Новый подход к решению проблемы донозологической диагностики : концепция и метод / В. В. Закурдаев, Ю. В. Лизунов, Вл. В. Закурдаев, В. Г. Козлов // Гигиена и санитария. – М. : Медицина. - №6. – 2004. – С. 66 - 69.