Биологические науки/6. Микробиология

Гудзенко Т.В., Волювач О.В., Бухтияров А.Є., Конуп І.П., Бєляєва Т.О., Лісютин Г.В., Горшкова О.Г., Пузирьова І.В., Дімова М.І., Денісов Г.Г.

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса

Оцінка нафтоокиснювальної активності мікроорганізмів, виділених із нафтозабруднених грунтів о. Зміїний

Токсичні компоненти, що входять до складу забруднених грунтів о. Зміїний, такі як нафта і нафтопродукти, а також значний вміст мінеральних солей чинять негативний вплив на місцеві біоценози, порушують ґрунтовий покрив, збіднюють рослинність.

Проблема рекультивації грунтів з хронічним нафтовим забрудненням і різним ступенем засолення повністю не вирішена. Існуючі методи рекультивації, такі як механічні, фізико-хімічні, не забезпечують в повній мірі ефективної очистки [1, 2].

У зв'язку з цим розробка комплексного екологічно безпечного біотехнологічного способу рекультивації нафтозасолених ґрунтів становиться не просто актуальною, а вкрай необхідною.

На сьогоднішній день біоремедіація нафтозабруднених грунтів о. Зміїний може забезпечити економічно вигідне, специфічне і екологічно “м’яке” зменшення концентрації нафтових забруднень до фонових значень.

Перешкодами у досягненні цієї мети є відсутність експериментальних даних по дослідженню нафтодеструктивної активності природних аборигенних мікроорганізмів за умов підвищеної мінералізації, встановлення їх оптимального температурного режиму для окиснення нафти та ін.

Ці дослідження важливі при складанні біопрепаратів на основі асоціації грунтових мікроорганізмів, ізольованих із нафтозабруднених грунтів о. Зміїний, і деяких штамів бактерій роду Pseudomonas (P. fluorescens ONU328, P. maltophilia ONU329, P. cepacia ONU327), що зберігаються в музейній колекції непатогенних мікроорганізмів кафедри мікробіологіі, вірусологіі та біотехнології ОНУ імені І.І. Мечникова. Наші попередні дослідження показали, що усі ці штами бактерій характеризуються високою нафтоокиснювальною активністю [3].

За період квітень-травень 2013 р. з двох нафтозабруднених ділянок ґрунту о. Зміїний методом накопичувальних культур на рідкому середовищі МКД з додаванням нафти, з подальшим висівом на щільне агаризоване середовище з нафтою виділено 10 штамів мікроорганізмів (1₅, 1₆, 1₇, 1₈, 1₁₀, 2₂, 2₄, 2₅, 2₆, 2₈). За результатами ідентифікації вони були віднесені до роду Bacillus.

Інкубацію накопичувальних культур, виділення вуглеводеньокиснюючих мікроорганізмів і вивчення їх нафтоокиснювальної активності проводили за температури 28º для виявлення мезофілів.

Для ізоляції із забруднених нафтопродуктами ґрунтів біохімічно-активних бактерій–деструкторiв вуглеводнів нафти використовували рідке синтетичне середовище МКД наступного складу: K₂HPO₄ - 1 г, NH₄Cl - 1 г, дріжджовий екстракт - 0,5 мг, дистильована вода - 1 л, субстрат (нафта з густиною 0,84 г/см³), рН середовища - 7,2-7,5. По 10 мл середовища МКД додавали в пробірки, які закривали лабораторною фольгою. Стерилізацію проводили в автоклаві під тиском у 1 атм (121^оС) протягом 20 хвилин.

Нафту з густиною 0,84 г/см³ стерилізували в окремій колбі, закритій притертою скляною кришкою в автоклаві під тиском у 1 атм (121^оС) протягом 20 хв. Субстрат додавали безпосередньо в пробірки з МКД і бактеріальними суспензіями за допомогою дозатора, одержуючи концентрацію вуглеводнів нафти у середовищі - 0,1 % (10 мг нафти на 10 мл поживного середовища – контроль, 10 мг нафти на 10 мл бактеріальної суспензії).

Культивування посівів проводили при кімнатній температурі (22 ⁰С) протягом 7 діб. На сьому добу в пробірках визначали наявність росту бактеріальної біомаси у порівнянні з контрольною пробіркою (середовище МКД з нафтою у відсутності мікроорганізмів).

Деструктивну активність 10 відібраних штамів роду Bacillus 1₅, 1₆, 1₇, 1₈, 1₁₀, 2₂, 2₄, 2₅, 2₆ і 2₈ оцінювали за візуальним спостереженням через 7, 14, 30 та 60 діб.

На 60 добу було виявлено п’ять найбільш активних штамів бактерій 1₅, 1₇, 2₂, 2₄ і 2₆, що належать до роду Bacillus. Показником деструктивної активності було зменшення нафтової плями, щезання запаху нафтопродуктів, зміна кольору нафтової плями від темного до рудоватого. Також відмічали хороший приріст біомаси за зміною прозорості або кольору середовища і за появою бактеріальних плівок під нижнім шаром нафти, утворення пластівців у товщі середовища.

Через 90 діб провели фізико-хімічний аналіз і визначили методом інфрачервоної (ІЧ) спектрометрії, використовуючи прилад ИКС-29, залишковий вміст вуглеводнів нафти в контрольній пробі і у пробах, які містили штами грунтових бактерій 1₅, 1₇, 2₂, 2₄ і 2₆ роду Bacillus.

Враховуючи усі фізико-хімічні і біохімічні процеси, дійшли висновку, що грунтові мікроорганізми, виділені із нафтозабрудненого грунту о. Зміїний, в лабораторних дослідах утилізують 0,1 % нафту на 30,2-74,0 % і за своєю нафтодеструктивною здатністю розташовуються в такій послідовності: 2₄ >1₇ > 2₂ > 1₅ = 1₇.

Таким чином, пропонуємо використовувати для виготовлення біопрепарату з широким спектром нафтоокиснювальної дії в екстремальних умовах навколишнього середовища асоціацію штамів бактерій Bacillus sp. 2₄ (74,0%), Bacillus sp. 1₇ (66,7%), Bacillus sp. 2₂ (47,6%), P. fluorescens ONU328, P. maltophilia ONU329, P. cepacia ONU327. Принципово новий біопрепарат здатен біодеградувати вуглеводні нафти та нафтопродукти у вигляді водорозчинної, емульсованої, плівкової форми та здійснювати утилізацію залишкової замазученості грунту.

Література:

1. Королев В.А., Ситар К.А. Рекультивация нефтезагрязненных земель // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. – 2004. - № 2. – С. 69-76.

2. Кузнецов Ф.M. и др. Рекультивация нефтезагрязненных почв. – Пермь: Перм. гос. техн.. ун-т. – 2000. – 105 с.

3. Гудзенко Т.В. и др. Нафтоокиснювальна активність деяких штамів бактерій роду Pseudomonas // Мікробіологія і біотехнологія. – 2013, № 4. – С. 24-30.