Биохимические изменения всубклеточнқх фракциях гепатоцитов при экспериметальном ишемическом инсульте

Машарипов С.М., Курбанова Н.Н.

Ташкентская медицинская академия, Ургенчский филиал.

Изменения в антиоксидантной системе субклеточных фракций гепатоцитов при экспериметальном ишемическом инсульте.

АННОТАЦИЯ

статьи Машарипова С.М., Курбановой Н.Н. на тему: «Изменения в антиоксидантной системе субклеточных фракций гепатоцитов при экспериметальном ишемическом инсульте».

Статья посвящена актуальному вопросу экспериментальной неврологии: изучению антиоксидантной системы субклеточных фракций гепатоцитов при экспериметальном ишемическом инсульте. Установлено наибольшее снижение активности супероксиддисмутазы и каталазы в митохондриальной и микросомальной фракциях печени через 6 часов после реперфузии. К 3 и 10 суткам обнаружена тенденция к восстановлению супероксиддисмутазы и нормализация активности каталазы.

Актуальность проблемы. Инсульт и хроническая ишемия головного мозга, являются в настоящее время, наряду с тяжелыми травмами, ведущими причинами инвалидизации (1). Прогрессирующий рост цереброваскулярной патологии приводит к значительному росту не только острых инсультов, но и числа пациентов с хронической ишемией головного мозга. При ишемии головного мозга наблюдается стимуляция окислительного стресса в клетках, что связано с гипоксией (2). Однако, самым опасным для жизнедеятельности клеток является не отсутствие кислорода, а его появление после длительной ишемии. В частности, именно окислительный стресс играет основную роль в повреждении клеток при ишемии (3), где по данным (4), даже невысокая степень и относительная продолжительность ишемии головного мозга не может не сказаться на состоянии жизненно важных органах, таких как печень и почки. Ткани головного мозга весьма чувствительны к гипоксии и отличаются высоким потреблением кислорода (5). Известно, что при ишемии головного мозга наблюдается перераспределение кислорода в организме в пользу головного мозга (6). Снижается парциальное давление кислорода во внутренних органах, в частности в печени и почках. Исследований посвященных изменениям в мембранных компонентах печени и почках при экспериментальном ишемическом инсульте весьма ограничены.

Целью настоящего исследования явилось изучение активности ферментов антипероксидной и антирадикальной защиты в митохондриальной и микросомальной фракциях гепатоцитов в динамике экспериментальной ишемии и реперфузии головного мозга.

Материал и методы исследования. Работа выполнялась на беспородных крысах-самцах весом 120-130 г, находившихся на стандартном рационе вивария. Модель нарушения мозгового кровообращения - ишемии воспроизводилась путем временного клипирования правого ствола безымянной артерии на 20 минут. После устранения клипсы рану послойно ушивали. Подтверждение воспроизведения ишемии осуществлялась морфологическими методами исследования (окраска по методу Ниссля). Контролем служили животные, которым вскрывали безымянную артерию с последующим ушиванием раны (ложнооперированнқе животные в количестве 6-8 штук на каждый срок эксперимента). Интактную группу составили животные той же возрастной группы, находившихся в аналогичных условиях вивария (n =9). Митохондриальная и микросомальная фракции из гомогената печени разделяли методом дифференциального центрифугирования. Активность супероксиддисмутазы определяли по методу Misra P.H. et al.,(7) и выражали в процентах торможения реакции автоокисления адреналина в щелочной среде (Т%), активность каталазы – по методу Королюк М.А. и др.,(8) и выражали в ммоль Н₂О₂/мг белка*мин. Белок определяли методом Lowry O.H. et al., (1951). Исследования проведены на 1, 3, 6, 12, 24 часа, а также на 3 и 10 сутки после операции. На каждый срок исследования использованы по 7-8 крыс. Статистическую обработку полученных данных, проводили в компьютере с пакетом программ для математической обработки.

Полученные результаты и их обсуждение. Сравнение активности ферментов каталазы и СОД в МХ и МС фракциях печени группы ложнооперированных животных в динамике ишемии реперфузии головного мозга показало отсутствие достоверных изменений по срокам исследования, а также между аналогичными показателями группы интактных крыс. Изучение активности ферментов антирадикальной и антипероксидной защиты при ишемии реперфузии показали существенные изменения в активности ферментов антипероксидной и антирадикальной систем в субклеточных фракциях печени (табл.1). В ранние сроки ишемии реперфузии обнаружено резкое снижение активности СОД микросомальной фракции (МС) гепатоцитов, имеющий экстремальный характер с минимумом после 6 часа после реперфузии. Уменьшение активности фермента антирадикальной защиты было в 3,25 раза по сравнению с контролем. В митохондриальной фракции снижение активности было менее выраженным и через 6 часов после реперфузии было в 1,38 раза меньше показателя контроля.

Таблица 1.

Активность СОД в динамике ишемии

- реперфузии головного мозга, M ±m

СОД	Интактные живот ные (n=9)	1 ч	3 ч	6 ч	12 ч	24 ч	3 суток	10 суток
МС печени	85,3 ± 4,1	40,2 ± 1,9*	31,0 ± 3,0*	26,4 ± 2,8*	28,0 ± 2,2*	29,1 ± 1,8*	33,2 ± 2,7*	37,0 ± 3,3*
МС печени	85,3 ± 4,1	86,1 ± 2,9	85,7 ± 3,6	85,9 ± 4,3	85,4 ± 4,9	86,3 ± 3,8	85,1 ± 2,7	85,4 ± 3,6
МХ печени	90,0 ± 4,4	87,2 ± 2,2	69,9 ± 1,7*	65,1 ± 1,3*	68,0 ± 1,4*	69,0 ± 1,4*	71,2 ± 1,1*	71,9 ± 2,1*
МХ печени	90,0 ± 4,4	88,5± 2,8	89,3 ± 1,9	87,5 ± 2,6	88,9 ± 3,3	88,6 ± 3,7	85,6 ± 4,2	89,6 ± 2,5

Примечание: в числителе - данные животных с экспериментальной ишемией реперфузией головного мозга; в знаменателе – данные контрольной группы; * - достоверно по отношению к контролю;

n - число использованных животных.

При клинических исследованиях у новорожденных с гипоксически ишемической энцефалопатией в крови обнаружено увеличение активности СОД, сопровождавшееся снижением активности каталазы (8) . Экспериментальные исследования активности СОД в МХ фракции печени крыс при ишемии реперфузии головного мозга показал временную зависимость изменений от сроков реперфузии (9). Обнаружены определенные временные параметры морфологических изменений в печени после ишемии реперфузии головного мозга в эксперименте (10).

В последующие сроки исследования (3,10 сутки) отмечалось незначительное увеличение активности СОД (Р< 0,05) МС фракции печени, активность которой была ниже уровня контроля в 2,31 раза.

Таблица 2

Активность каталазы в динамике ишемии-

реперфузии головного мозга, M ±m

Ката-лаза	Интактные живот-ные	1 ч	3 ч	6 ч	12 ч	24ч	3 суток	10 суток
МС печени	21,2 ± 0,5	24,0 ± 0,7	17,9 ± 0,3*	17,0 ± 0,6*	17,5 ± 0,6*	18,0 ± 0,6*	18,4 ± 0,3*	18,8 ± 0,6
МС печени	21,2 ± 0,5	21,8 ± 0,8	22,1 ± 0,3	21,9 ± 0,4	22,1 ± 0,5	22,0 ± 0,4	21,9 ± 0,4	22,2 ± 0,8
МХ печени	62,3 ± 1,3	78,5 ± 2,0*	56,3 ± 1,8*	51,0 ± 2,2*	51,8 ± 2,0*	57,1 ± 1,9*	55,3 ± 1,9	58,4 ± 1,6
МХ печени	62,3 ± 1,3	61,8 ± 1,9	62,1 ± 2,1	62,5 ± 2,3	61,9 ± 1,8	62,5 ± 1,7	63,0 ± 2,3	61,8 ± 2,3

n - число использованных животных.

Ишемия с последующей реперфузией приводит к изменениям в системе антирадикальной и антипероксидной активности организма, выраженные как в ткани головного мозга по данным литературы (11), так и в печени (табл. 2). СОД и каталаза, являются мощным антиокислительным тандемом, обеспечивают защиту от супероксиданиона и перекиси водорода, образующихся как внутри клеток, так и во внеклеточном пространстве, поддерживая оптимальный для жизнедеятельности уровень генерации активных форм кислорода (АФК). При этом защита клеточных структур от повреждающего действия АФК, продуцирующихся внутри клетки (эндогенные АФК) и воздействующих извне (экзогенные АФК) организуется различным образом (12).

Активность каталазы в МС фракции изменялась волнообразно: с незначительным увеличением через 1 час после реперфузии и снижением активности в 1,18-1,25 раза относительно контроля через 3-6 часов после ишемии реперфузии, причем, на 3 - 10 сутки наблюдалось восстановление активности фермента антипероксидной защиты. Следовательно, в МС фракции печени изменения активности СОД и каталазы носят однонаправленный характер, и отличаются выраженностью сдвигов.

В МХ фракции наблюдалась аналогичная тенденция, и через 6 часов после реперфузии обнаружена минимальная активность СОД, которая была ниже контроля в 1,32 раза. В последующие сроки исследования отмечалось незначительное увеличение активности СОД (Р> 0,05), которая к 10 суткам была ниже уровня контроля в 1,25 раза. Активность каталазы в МХ фракции печени после 1 часа реперфузии увеличивалась в 1,26 раза относительно контроля (табл. 2). В последующие сроки отмечалось снижение активности каталазы с минимумом к 6 часам реперфузии (в 1,23 раза относительно контроля, табл. 2). В последующие сроки исследования уровень активности каталазы достигала контроля (в 1,07 раза), значения, которых были в статистически недостоверных пределах.

Рассматривая механизмы изменений активности ферментов антирадикальной и антипероксидной защиты печени можно отметить, одним из ведущих причин, видимо, является перераспределение кислорода в организме экспериментального животного в пользу пораженного органа. По мнению Петрухина А.С.(2008) в ответ на гипоксию в тканях мозга повышается скорость кровотока с увеличением минутного объема, а общий кровоток в первые часы перераспределяется так, чтобы сохранить обеспечение кислородом головной мозг, «обкрадывая» внутренние органы (6). Определенно, происходит снижение парциального давления в печени, что, видимо и явилось причиной активации образования АФК и соответствующему сдвигу в антиокислительной системе МС и МХ фракций гепатоцитов (14) в различные сроки ишемии реперфузии головного мозга. Видимо, морфологические изменения в печени обнаруженные авторами (11) в ранние сроки ишемии реперфузии головного мозга связано со снижением активности антипероксидной и антирадикальной систем защиты в первые 6 часов после реперфузии

Выводы.

1. В результате экспериментальной ишемии и реперфузии головного мозга в Мс фракциях гепатоцитов обнаружены однонаправленные изменения в активности антипероксидной и антирадикальной защиты с максимумом снижения через 6 часов после реперфузии.

2.При экспериментальной ишемии реперфузии головного мозга в МХ фракции печени обнаружено снижение активности СОД и каталазы с наибольшим снижением также через 6 часов после восстановления кровотока.

Указатель литературы.

1. Пирадов М.А. Интенсивная терапия инсульта: взгляд на проблему. //Анналы клин. и эксперим. неврологии, 2007.- 1(1).-с. 17–22.

2. Алимов А.В., Ахмедова Д.И., Сигатуллина М.И., Хайбуллина З.Р. Этиопатогенетические и клинические особенности гипоксически-ишемической энцефалопатии у доношенных новорожденных // Вестник врача общей практики.-2009.-№3, II часть.-С. 75-77.

3. Keir S.L., Wardlaw J.M. Systematic review of diffusion and perfusion imaging in acute ischemic stroke.// Stroke.-2000.- 31(11).-р. 2723–2731.

4. Saver J.L., Wilterdink J. Choline precursors in acute and subacute human stroke: a meta-analysis.// Stroke.-2002.- 33.-р.- 353-358.

5. Хайбуллина З.Р., Ибрагимов У.К. Известные молекулярные механизмы нейронального повреждения при гипоксии мозга плода, обзорная статья // Медицинский журнал Узбекистана.-2009.-№2.-с.64-72.

6. Клиническая детская неврология./Под ред. А.С. Петрухина: Руководство.-М.:ОАО «Издательство «Медицина»,2008.-1088 с.

7. Mirsa P.H., Fridovich I. The role of superoxide anion in the antioxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. // J. Biol. Chem. - 1972. - V. 247.- №10.- P.3170-3175.

8. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Ф. Метод определения каталазы.// Лаб. Дело.-1988.-С. 16-19.

9. Хайбуллина З.Р., Ибрагимов У.К., Салихова С.Р., Муфаздалов Ш.А. Реакция клеточных элементов крови на общую гипоксию организма.//Патология.-Ташкент.-2010.-№1.-с.27-36.

10. Ибрагимов К.У., Хайбуллина З.Р. Состояние микросомааальной и митохондриальной фракций печени при экспериментальной ишемии мозга у крыс.// Вестник РГМУ. Журнал Всероссийского Государственного медицинского университета. 2009,-№3.-стр. 243.

11. Сайфиева Х.Д., Ибрагимов У.К. Морфологические изменения в печени при экспериментальном инсульте.// Вестник РГМУ. Журнал Всероссийского Государственного медицинского университета. 2009,-№3.-стр. 65-66.

12. Хайбуллина З.Р., Ибрагимов У.К., Ахмедова Д.И. и др. Влияние церебролизина ин витро на антипероксидную защиту при экспериментальной ишемии мозга у крыс.// Неврология.-2008.-№3-4.-стр.257.

13. Соатов Т.С.,Ибрагимов У.К., Хайбуллина З.Р. Биологик системаларда кислороднинг эркин радикалларининг таъсири ва химоя механизмлари. (Монография) Ташкент, 2009, 80 бет.

14. Хайбуллина З.Р., Ибрагимов У.К., Аскарьянц В.П., Бабаджанова Ф.А., Хамраев У.А. Современные концепции механизма действия антиоксидантов и некоторые аспекты использования кислорода в живых клетках.//Вестник врача общей практики.-2010.-№ 3-4.-Самарканд.-с. 100-102.