К. в. н. Осипова Б. А., д. в. н. Гершун В. И.

Костанайский государственный университет им. А. Байтурсынова

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИИ ЛИСТЕРИЙ В КАПУСТЕ

Листериоз является широко распространенной инфекционной болезнью, наносящей значительный ущерб животноводству и представляющей серьезную угрозу здоровью людей. Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена особенностями биологии ее возбудителя, наличием большого числа как патогенных, так и непатогенных штаммов, недостаточной изученностью генома и антигенной структуры микробных клеток.

Возбудитель листериоза достаточно устойчивый во внешней среде. При благоприятных условиях (низких температурах, достаточной влажности) обладает способностью не только длительно сохраняться, но и размножаться при 4-6°С в почве, воде, пищевых продуктах (мясе, молоке, овощах, квашеной капусте), в том числе при хранении продукции в холодильнике.

Необходимо отметить, что листериоз является сапронозной инфекцией, при которой вегетативные клетки листерий могут переходить в L -формы, а также в некультивируемое состояние [1].

С целью изучения морфологических свойств листерий нами изучена жизнеспособность их в стерилизованном соке белокочанной и краснокочанной капусты при различных температурных режимах. Для этого из проб свежей белокочанной и краснокочанной капусты, при помощи соковыжималки, получали капустный сок, который разливали в пробирки, стерилизовали, затем инфицировали листериями из расчета 150 КОЕ/мл. Пробы сока выдерживали в термостате при температуре 37°С, при комнатной температуре 18-20°С, в холодильнике при 4°С.

Исследования показали, что при посеве из капустного сока в первые дни опыта на МПА с налидиксовой кислотой листерии не отличались по своим морфологическим признакам от исходных штаммов, которые росли в виде колоний S-формы.

Спустя 9-11 суток в посевах из стерилизованных проб сока белокочанной капусты, хранившихся при 37ºС листерии росли в виде колоний R-формы и их промежуточных вариантов. Результаты исследований приведены в сводной таблице 1.

Таблица 1

Диссоциация и L-трансформация листерий в капустном соке при 37°С

(сводные данные)

Вид капусты	Число проб	Сроки обнаружения, сутки
		R-формы	L-формы
Стерилизованный сок белокочанной капусты	3	9-11	17-19
Стерилизованный сок краснокочанной капусты	3	12-14	16-18

В последующие сутки в посевах из этих проб преобладали колонии R-формы, зачаточные узелки и нити колоний, которые были хорошо видны при фазово-контрастной микроскопии. Колонии R-формы и зачаточные узелки состояли из нитевидных форм, длина которых колебалась в пределах 15-300 мкм.

В стерилизованных пробах сока краснокочанной капусты на 12-14 сутки также отмечался рост колоний R-форм (рисунок 1). Дальнейший пересев R-форм сопровождался утратой их и появлением роста только S-формы. В связи с этим появление в данном случае R-форм следует рассматривать не как истинную диссоциацию листерий, а как результат их временной модификации. Зачаточные узелки и нити при пересевах не давали роста и их рекультивировать не удавалось. В аналогичных посевах из проб, хранившихся при 4-18ºС явление диссоциации не отмечалось.

Рисунок 1 - Колонии R-формы листерий (увел. 18)

Таким образом, в капусте при температуре 37°С спустя 9-12 суток размножение листерий сопровождалось диссоциацией и появлением в популяции микробных клеток, у которых процесс формирования колоний прерывается на стадии микроскопически видимых зачаточных узелков и нитей. По-видимому, зачаточные узелки и нити колоний являются образованиями микробных клеток в стадии перехода их в субклеточные формы, которые, как известно не дают роста в виде колоний.

R-формы листерий спустя 11-14 суток не обнаруживались и на смену им появлялись L-формы.

В посевах из проб белокочанной и краснокочанной капусты на 14-15 сутки отмечался рост колоний, которые следует рассматривать как переходную стадию L-форм. Они имели шаровидную форму с ровными краями и плотным центром.

Микроструктурные элементы этих колоний состояли из сферических тел, содержащих вакуоли и гранулы, и были отнесены к М-формам. Это шаровидные тела разных размеров и разной оптической плотности. Спустя 16-17 суток в посевах из стерилизованных проб сока белокочанной и краснокочанной капусты отмечался рост типичных колоний L-форм. Они имели слизистую консистенцию, нежный, прозрачный, кружевидный край и более плотный, оптически недифференцируемый центр, врастающий вглубь среды (рисунок 2, 3). Размеры этих колоний колебались в пределах 0,5-2 мм и они состояли из темных и белых шаровидных тел разных размеров и разной оптической плотности, нитевидных и вакуолизированных форм, содержащих включения разнообразных гранул, субмикроскопических частиц. Клеточное содержимое было зернистым, состоящим из шаровидных тел и структур, не имеющих определенной формы (рисунок 4).

Явление L-трансформации листерий в пробах, хранившихся при 4-18ºС не установлено. Таким образом, в процессе жизнедеятельности листерий в капустном соке при температуре 37ºС происходит их L-трансформация.

Рисунок 2 - Колонии L-формы листерий.

Фазово-контрастная микроскопия (увел. 50)

Рисунок 3 - Колония L-формы листерий.

Фазово-контрастная микроскопия (увел. 308, деталь рисунка 2)

Рисунок 4 - Микроскопические структурные элементы L-форм листерий. Фазово-контрастная микроскопия (увел. 1150)

При 1-2-кратном пересеве L-форм колоний отмечался рост обычных бактериальных колоний, микроструктурные элементы которых состояли из гигантских клеток, шаровидных или грушевидных тел и иногда вакуолизированных форм. Таким образом, полученные L-формы листерий были не стабильными и при дальнейших пересевах на питательных средах, происходила их реверсия.

На основании полученных данных разработан новый способ получения L-форм листерий. С этой целью белокочанную и краснокочанную капусту и их отходы (листья, нестандартная капуста) измельчали при помощи мясорубки, помещали в закрытый сосуд или полиэтиленовые мешочки слоем высотой 2-3 см и выдерживали при комнатной температуре 3-4 суток. Затем из этой капустной массы при помощи соковыжималки получали капустный сок, определяли его рН (6,5-7,8) и в дальнейшем готовили среду по общепринятой методике (разливали в пробирки, стерилизовали и т.д.). Пробирки со стерильным капустным соком использовали для культивирования листерий. Через каждые трое суток производили посевы на пластинки МПА, содержащего 0,004% налидиксовой кислоты. Морфологические, культуральные свойства листерий изучали при помощи световой и фазово-контрастной микроскопии. На 15-25 сутки в посевах из опытных проб, хранившихся при 37°С листерии росли в виде колоний L-формы и их промежуточных вариантов. В опытных пробах обнаружены методом «раздавленной капли», характерные для L-формы колонии, которые состояли из шаровидных, грушевидных, пузыревидных, вакуолизированных и нитчатых форм.

Таким образом, при длительном культивировании листерий в капустном соке в условиях термостата происходит образование L-форм листерий.

Процесс диссоциации некоторые исследователи рассматривают как ответную реакцию микроорганизма, возникающую при условиях, неблагоприятных для развития данного вида. Некоторые ученые рассматривают L-трансформацию бактерий - как приспособительную (адаптивную) изменчивость микробов, под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды [2,3].

В.И. Гершун при культивировании листерий в почве, силосе и растительных субстратах при 18-25°С установил их диссоциацию спустя 21-35 суток и L-трансформацию спустя 4-5 месяцев [3]. Автор не сообщает о диссоциации и L-траснформации листерий при 37°С.

В.А. Тимаков и Г.Я. Каган считают, что L-форма бактерий является способом их персистирования – переживания в неблагоприятных условиях [4].

Согласно нашим данным, в результате длительного культивирования листерий в капустном соке при 37°С происходит вначале их диссоциация, а затем L-трансформация. Явление L-трансформации листерий в пробах, хранившихся при 4-18ºС не установлено. На основании полученных данных разработан новый способ получения L-формы листерий.

Предложенный способ культивирования листерий позволяет использовать доступное и дешевое сырье (капусту) для изготовления среды, расширяет диапазон сред, применяемых для культивирования листерий, позволяет изучить биологические свойства листерий в новой среде.

Литература:

1. Жаргалова Т.Т. Идентификация патогенных листерий с помощью полимеразной цепной реакции. Автореф. канд. дисс. - 2002. - С. 2-3.

2. Таршис М.Г. Эпизоотологический прогноз и противоэпизоотический план. - М.: 1979. - С. 43-45.

3. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных // Алма-Ата: Кайнар.: 1981. - С. 27-32.

4. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. Журн. микробиол. - 1977. - № 4. - С. 3-11.