Одноклітинні еукаріоти як продуценти

Одноклітинні еукаріоти як продуценти

фактору некрозу пухлин

Харченко Є.

Національний університет харчових технологій, Україна

Біологічна роль фактору некрозу пухлин. Фактор некрозу пухлин (ФНП) – (TNF-альфа, або кахектін), позаклітинний білок, багатофункціональний прозапальний цитокін, який синтезується в основному моноцитами і макрофагами. Впливає на ліпідний метаболізм, коагуляцію, стійкість до інсуліну, функціонування ендотелію, стимулює продукцію інтерлейкінів (ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-8), інтерферону-гамма, активує лейкоцити, один з важливих факторів захисту від внутрішньоклітинних паразитів і вірусів. ФНП є прототипом для цілого суперсімейства, яке включає 19 різних білків, які служать лігандами для 29 рецепторів [1].

ФНП синтезується активованими макрофагами як мембранний білок з молекулярною масою 26-32 кДа (233-281 амінокислоти). Після дії специфічної металопротеази, так званого ФНП-конвертуючого ферменту (ADAM17), мембранно-зв’язуючий фрагмент відщеплюється і утворюється розчинний ФНП з молекулярною масою 17 кДа (157 амінокислот). Біологічною активністю володіє тримірна форма ФНП, що утворюється за рахунок іонної і гідрофобної взаємодії мономерів, і здатна зв’язуватися з рецепторами на різних типах клітин.

ФНП характеризується досить широким спектром біологічної активності і бере участь у багатьох фізіологічних і патологічних процесах, основні з яких:

ü противірусний, протипухлинний і трансплантаційний імунітет;

ü пригнічує ріст пухлинних клітин і регулює ряд обмінних процесів, а також активність імунної відповіді на інфекційні агенти.

Біологічні ефекти ФНП залежать від його концентрації. У низьких концентраціях він діє в місці індукції, як пара- і аутокринний регулятор аутоімунних реакції при травмах або інфекції. Він основний стимулятор для нейтрофілів і ендотеліальних клітин, для їх адгезії і подальшої міграції лейкоцитів, проліферації фібробластів і ендотелію при загоєнні рани. У середніх концентраціях ФНП-альфа, потрапляючи в кров, діє як гормон, створюючи пірогенний ефект, стимулює утворення фагоцитів, посилює згортання крові, знижує апетит. Цитотоксичну дію ФНП на пухлинну клітину пов’язують з деградацією ДНК і порушенням функціонування мітохондрій [2].

Способи отримання фактору некрозу пухлин. Перше покоління очищених препаратів фактору некрозу пухлин-альфа отримували завдяки культивуванню імунокомпетентних тваринних або людських клітин (макрофаги), стимулюючи утворення ФНП бактеріальними ліпополісахаридами. Але, отримання препарату таким способом є довготривалим і трудомістким, крім того клітини-продуценти не забезпечують високий вихід цільового продукту.

Іншим способом є використання генетично модифікованих клітин багатоклітинних еукаріотів. Серед багатоклітинних організмів найбільшого практичного використання для отримання ФНП набули клітини яєчника китайського хом’ячка (клітини СНО). Проте виробничий процес з використанням рекомбінантних клітин СНО доволі вартісний, а синтезуємий ФНП відрізняється від людського типу, і в деяких випадках, потребує додаткової модифікації [3].

Наступним поколінням препаратів ФНП стали препарати, отримані на основі рекомбінантних одноклітинних про- та еукаріот. Серед прокаріот найбільш відомими продуцентами є клітини Escherichia coli. Зокрема, створено штам Е. coli BL21(DE3) pTNF5, що характеризується виходом ФНП 70 мг/л за тривалості культивування – 8 год. При чому за його культивування на початку процесу біосинтезу додають індуктор ізопропіл β-D-1-тіогалактопіранозід (IPTG) [4]. Іншим продуцентом є E. coli BL21(DE3) hTNF-pET11, процес культивування якого характеризується збільшеною тривалістю (11,5 год) і нижчим виходом ФНП – 50 мг/л. Індуктор IPTG вносять у середовище після досягнення необхідного значення оптичної щільності культуральної рідини [5]. Порівняно з попередніми штамами, отримання ФНП з використанням E. coli C600/pBV-TRAIL має суттєві відмінності: процес культивування триває 30 год, а вихід ФНП – 1600 мг/л. Особливістю ведення біотехнологічного процесу є збільшення температури культивування для індукції синтезу цільового білка від 30 °C на початку процесу до 42 °С через 26 годин культивування [6].

Крім генетично модифікованих прокаріотичних клітин, для отримання ФНП розроблені технології з використанням рекомбінантних одноклітинних еукаріот. В основному це дріжджі родів Pichia, Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis.

Використання одноклітинних еукаріотів для отримання фактору некрозу пухлин. Серед рекомбінантних одноклітинних еукаріот найбільш поширеними продуцентами ФНП є дріжджі (табл.). Серед них Pichia pastoris – дріжджі, які є одними із найбільш широко використовуємих систем експресії. Р. pastoris являється досить зручною платформою для виробництва рекомбінантніх білків. Цей вид дріжджів є універсальним штамом-продуцентом і у поєднанні з відповідними векторами утворює доступні системи експресії генів, що кодують необхідний білок, в тому числі – рекомбінантний ФНП. Р. pastoris легко культивувати до великої щільності клітин у простому середовищі з мінеральних солей в контрольованих біореакторах.

Відомі публікації, в яких, використовуючи рекомбінантний штам дріжджів Р. pastoris GS115 (his4), отримували досить великий вихід рекомбінантного ФНП. Культуру дріжджів культивували у колбах на качалках і у ферментері, використовуючи мінімальне гліцеринове середовище (MGY) такого складу (на 1 л): дріжджовий екстракт – 13,4 г; біотину – 0,00004 г; гліцерин – 10 мл. У випадку безперервного культивування або культивування з підживленням (1% розчин метанолу), вдавалося отримати ФНП високої якості. Культура мала найвищу продуктивність – 32 % від всіх розчинених білків, коли клітини вирощували на середовищі з гліцерином, що складав 200 мл/л культуральної рідини. Суха вага клітин дріжджів становила 108 г/л. Для індукції експресії ФНП, до культури додавали метанол (275 мл) протягом 189 годин [8, 9Ошибка! Закладка не определена.].

Таблиця

Синтез ФНП рекомбінантними штамами дріжджів

Продуцент	Особливості генної модифікації	Особливості процесу біосинтезу / джерело
S. cerevisiae 2805	Для ампліфікації ДНК, що кодує рекомбінантний білок ФНП використовували ЛПС-індуковані мононуклеарні клітини периферійної крові. Вектор знаходив під контролем гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогеназного (GPD) промотору.	Штам культивують у середовищі YEPD (г/л): дріжджовий екстракт – 10; пептон – 20; декстроза – 20. Режим культивування: температура – 30 °С; перемішування – 200 об/хв впродовж 40 год. Максимальна продук-тивність штаму-продуцента становить 2,5 мг/л активного рекомбінантного ФНП людини / [7].
P. pastoris GS115	Експресія гетерологічних генів Р. pastoris регулюється промотором AOX1. Цей промотор сильно репресується в клітинах, вирощених на глюкозі, гліцерині і більшості інших джерел вуглецю, але індукується метанолом. Це жорстке регулювання використовується в культурах Р. pastoris для вирощування клітин на гліцерині з подальшою індукцією метанолом.	Культура мала найвищу продуктивність – 32 % від всіх розчинених білків, коли клітини вирощували на середовищі з гліцерином (200 мл/л культуральної рідини). Суха вага клітин дріжджів становила 108 г/л. Для індукції експресії ФНП, до культури додавали метанол (275 мл) упродовж 189 годин / [8].
P. pastoris GТS115/ рTNF6-5	Штам дріжджів трансформували плазмідним вектором рTNF6-2. Ділянку ДНК, що кодує ФНП ізолювали з клітин лінії HL-60. Експресія гетерологічних генів Р. pastoris регулюється промотором AOX1.	P. pastoris GТS115/ рTNF6-5 вирощували на гліцеролі (концентація в середовищі 20%), температура – 30 °С; рН = 5 впродовж 189 годин. Після індукції метанолом спостерігався рівень експресії ФНП – 32 % / [9].

Також, варто зазначити, що для продукування ФНП можуть використовуватися інші роди рекомбінантних дріжджів: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Hansenula і Torulopsis, але мікроорганізми даних родів не виявили високої продуктивності й економічної рентабельності в порівнянні з дріжджами Р. pastoris, тому не знайшли практичного використання [9Ошибка! Закладка не определена.].

Як приклад можна навести штам S. cerevisiae 2805 трансформований плазмідою pYEATNF з промотором GPD. Штам культивують у середовищі YEPD: дріжджовий екстракт – 10 г/л; пептон – 20 г/л; декстроза – 20 г/л. Режим культивування: температура – 30 °С; перемішування – 200 об/хв; впродовж 40 год. Максимальна продуктивність штама-продуцента становить 2,5 мг/л активного рекомбінантного ФНП людини [7Ошибка! Закладка не определена.].

Отже, для виробництва рекомбінантного ФНП можливе використання різних експресійних систем мікроорганізмів як про-, так і еукаріот. Серед одноклітинних еукаріотів найбільш поширеною у використанні системою експресії є штами дріжджів Р. pastoris, які характеризуються високою продуктивністю і простотою індукції синтезу цільового білку. Використання штамів Р. pastoris є економічно вигідним, тому на даний час в масштабах промислового виробництва рекомбінантних білків саме цей вид дріжджів є найбільш поширеним.

Література:

1. Шмелёв В.А. РЕФНОТ. Рекомбинантный Фактор Некроза Опухолей-Тимозин-α1, препарат с низкой системной токсичностью для лечения онкологических заболеваний. – М.: Рефнот-Фарм, 2010. – 92 с.

2. Grivennikov S.I., Greten F.R., Karin M. Immunity, Inflammation, and Cancer // Elsevier Inc. – 2010. – Vol 140 – Р. 883-899.

3. Demain A.L., Vaishnav P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms // Biotec. Advances. – 2009 – Vol 27 – Р. 297-306.

4. Суровцева Е.В., Кузнецова Т.В., Хоменкова В.Г., Домагатский С.П., Шевелев А.Б. Новый штамм-продуцент фактора некроза опухолей человека на основе E. сoli // Биоорган. хим. – 2005. – № 5. – С. 474-481.

5. Curnis F., Corti A. Production and Characterization of Recombinant Human and Murine TNF // Methods in Molec. Med. – 2004 – Vol. 98. – P. 9-22.

6. Ai-You Sun, Ya-Ling Shen, Ji-Cheng Yin et al. Improvement of expression level and bioactivity of tumor necrisis factor-related apoptosis-inducing ligand (Apo2L/TRAIL) by a novel zinc ion feeding strategy // Biotech. Lett. – 2006. –Vol. 28. – Р. 1215-1219.

7. Seung-Moon Park, Ae-Young Mo, Yong-Suk Jang, et al. Expression of a functional human tumor necrosis factor-α (hTNF-α) in yeast Saccharomyces cerevisiae // Biotechnol. and Biopr. Eng. – 2004 – Vol. 9. – Р. 292-296.

8. Sreekrishna K., Lynn Nelles, Rica Potenz. High-level expression, purification, and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized in the methylotrophic Yeast Pichia pastoris // Biochemistry – 1989 – Vol. 28. – Р. 4117-4125.

9. Pat. USA № 5,002,876 East production of human tumor necrosis factor / Kotikanyadan S., Motohiro F., Rica H. – Publ. 26.03.1991.