Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара
ЛАБОРАТОРНИЙ
МОНІТОРИНГ ВІЛ-ІНФЕКЦІЇ
Вступ
Лабораторний моніторинг
є обов’язковою складовою ведення пацієнтів із ВІЛ. Виділяють такі аспекти
застосування лабораторного моніторингу: лабораторний моніторинг не є обов'язковим
для призначення антиретровірусної терапії (АРТ); визначення кількості
лімфоцитів CD4 і вірусного навантаження не є обов'язковим для спостереження за
ходом АРТ; пацієнтам, які отримують АРТ, рекомендується лабораторний моніторинг
безпеки і токсичності, що проводиться за клінічними показаннями.
Окрім того, якщо ресурси
дозволяють, для підтвердження підозри на невдачу лікування, слід відстежувати
імунологічні та/або клінічні критерії, показано вимір вірусного навантаження в рамках
цілеспрямованого підходу [2,
7].
Метою роботи було
охарактеризувати особливості
лабораторного моніторингу ВІЛ-інфекції.
Методи виявлення ВІЛ
На сьогодні основними
методами діагностики ВІЛ-інфекції є імуноферментний аналіз (застосовується як
для скринінгових, так і для верифікаційних досліджень) та полімеразна ланцюгова
реакція.
Методика імуноферментного виявлення антитіл
до ВІЛ базується на здатності специфічних антитіл, які можуть міститися в
сироватці інфікованої людини, специфічно зв'язуватися з вірусними антигенами і
утворювати комплекс антиген-антитіло, що можна виявити за допомогою спеціальних
біотехнологічних реактивів, які в свою чергу специфічно реагують із тими
антитілами, які "сіли" на вірусні антигени (до речі, в іншій назві
цього варіанту імуноферментного аналізу є термін "сандвіч", який
досить точно відбиває його сутність). Завдяки наявності в складі цих реагентів
певних ферментів (зокрема пероксидази), позитивна реакція супроводжується
зміною кольору рідини. Найчастіше в імуноферментному аналізі використовують
сумарні антигени ВІЛ. Проведення імунного блотінгу передбачає попередню
розгонку антигенів ВІЛ електрофорезом, що дає можливість виявляти антитіла до
цих окремих антигенів (при цьому для обліку реакції звичайно використовують
імунофлюоресценцію) [2, 4].
З метою діагностики
використовуються також методи виявлення вірусу, або антигенів, а також генного
матеріалу. Серед антигенів ВІЛ найчастіше намагаються виявляти білок p24 ВІЛ-1,
однак ця методика не знайшла належного застосування в епідеміологічних
дослідженнях, тому що велика кількість цього антигену зв'язується антитілами
тоді, коли останні з'являються в організмі людини (тобто знайти цей антиген
можна лише або у початковий період захворювання або вже при розвинутому СНІДі).
Тому даний метод використовується переважно для виявлення хворих на ранніх
стадіях ВІЛ-інфекції, для оцінки прогресування захворювання і як критерій
встановлення факту зараження дитини, народженої ВІЛ-інфікованою жінкою [3, 5].
Виділення й
ідентифікація культури ВІЛ є найбільш достовірною ознакою інфікування, однак,
цей метод малодоступний, вимагає тривалого часу, високої кваліфікації
виконавців та спеціального устаткування. Тому виділення вірусу і його
ідентифікація проводяться лише в деяких наукових установах.
Сучасні методи
дозволяють виділяти ВІЛ майже в усіх інфікованих ним осіб. Але варто пам'ятати,
що негативні результати однократної спроби виділити вірус, не мають ніякого
практичного значення, тому що такі спроби бувають вдалими лише в половині
випадків. Повідомлення лабораторії про виділення ВІЛ має велике діагностичне
значення, однак всі лабораторії ідентифікують його на підставі своїх перевірочних
тестів, і вірність цієї перевірки лікар оцінює лише за ступенем своєї довіри до
даної вірусологічної лабораторії. Неодноразово відзначалося, що деякі
вірусологи нібито "виділяли ВІЛ", з матеріалів, що не мають ніякого
відношення до хворих на ВІЛ-інфекцією, наприклад, від хворих вітряною віспою чи
епідемічним паротитом, чи навіть від зовсім здорових і неінфікованих людей.
Істотною проблемою є і те, що ідентифікація вірусу займає тривалий час [2, 5].
Нарешті, в останні роки
велику популярність завоював спосіб виявлення генного матеріалу ВІЛ методами
реплікації (ампліфікації, розмноження) специфічних генних послідовностей
вірусу. Ці методи поєднуються за назвою одного з його варіантів – «полімеразна
ланцюгова реакція» (ПЛР). Але нині вони мають чутливість лише в 98%, тобто
виявляють лише 98% від ВІЛ інфікованих осіб, що істотно нижче, ніж при
використанні імуноферментного аналізу (до 99,9%). Перевага методу ПЛР полягає в
тому, що він здатний виявляти ВІЛ-інфекцію в інкубаційному і ранньому
клінічному періоді, коли антитіл ще може і не бути, а також він виявляється
корисним для прогнозування перебігу захворювання і оцінки ефективності терапії.
Сьогодні цей метод найбільш широко застосовується для діагностики ВІЛ-інфекції
у дітей ВІЛ-інфікованих матерів, які майже всі при народженні мають материнські
антитіла [4].
Особливості лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції
До останнього часу не
припиняються суперечки: чи можна діагностувати ВІЛ-інфекцію без лабораторного
підтвердження. Сьогодні в нашій країні останнє не є проблемою через високу
доступність обстеження на виявлення антитіл до ВІЛ. Але це цілком можливо,
наприклад, в країнах Західної Африки. Клініцисти спостерігають безліч випадків,
коли діагноз ВІЛ-інфекції не викликає сумніву у лікаря вже з моменту збору
анамнезу і першого огляду пацієнта. Проте, у силу сформованої в країнах
колишнього СРСР традиції, мільйони людей і нині обстежуються на антитіла до ВІЛ
без визначених показань, і в більшості випадків лікар спочатку одержує дані
лабораторного дослідження (про позитивну реакцію на антитіла до ВІЛ), а лише
потім бачить самого хворого і може його опитати. За цих обставин медичний
працівник часто забуває, що лабораторне дослідження завжди служить лише
підтвердженням клінічного. У тих же випадках, коли лікар вже знає, що у
пацієнта виявлені антитіла до ВІЛ, він легко може помилитися, пішовши на поводу
в папірця з відповідним записом. Так, у 1985-1989 роках десятки пацієнтів
направлялися до Центрів профілактики та боротьби зі СНІДом через помилкові
лабораторні підтвердження ВІЛ-інфекції. У період 1987-1995 років на один дійсно
позитивний "лабораторний діагноз", заснований тільки на визначенні
антитіл до ВІЛ за допомогою імуноферментного аналізу, приходилося до 2000-3000
помилкових. Однак, сьогодні діагностика ВІЛ є значно більш точною, тому вона
має підтверджувати результати клінічного обстеження [5].
Найбільш відомим та
розповсюдженим методом лабораторного тестування на ВІЛ є виявлення антитіл до
нього. З огляду на те, що ВІЛ-інфекція триває довічно, вважається, що для
діагностики досить самого факту виявлення антитіл. Але слід пам'ятати, що не
завжди присутність ВІЛ супроводжується появою антитіл до нього і навпаки.
Досить широко відомі деякі ситуації, при яких вірус в організмі є (тобто людина
заражена), а антитіла до нього відсутні. По-перше, це початкова стадія
інфекції: після проникнення збудника в організм має пройти в середньому 1,5-3
місяці, доки антитіла не синтезуються в достатній для проведення лабораторного
тесту кількості. По-друге, на заключному етапі хвороби (СНІДу) імунна система
пацієнта стає настільки виснаженою, що її клітини втрачають спроможність до
утворення антитіл. Крім того, у деяких людей на ряд мікроорганізмів, в тому
числі ВІЛ, антитіла можуть не утворюватися зовсім. Так, в США з усіх випадків
ВІЛ-інфекції, які реєструються щорічно, на ті, при яких антитіла не
визначаються, припадає близько 1 %. Має місце й інша ситуація – специфічні
антитіла виявлені, а насправді вірусу немає. Перш за все це буває у немовлят,
народжених ВІЛ-інфікованими жінками. Багаторічними спостереженнями доведено, що
навіть за відсутності специфічного профілактичного лікування вагітних лише
третина таких дітей дійсно заражена, а в інших є тільки материнські антитіла,
які звичайно зникають до 15-місячного віку. Якщо ж під час вагітності жінка
отримувала противірусні препарати, ризик народження нею інфікованої дитини
знижується до 2-8%, тобто 92-98% новонароджених будуть здоровими, але переважна
більшість їх матимуть антитіла [4].
Також, дігностично важливим
є визначення вірусного навантаження у ВІЛ інфікованих осіб.
Вірусне навантаження –
це кількість вірусу ВІЛ у крові інфікованого.
Вірусне навантаження
більше за 100 тис. копій/мкл вважається високим, а менше 10 тис. копій/мкл –
низьким. Але необхідно приймати до уваги, що якщо людина не приймає
АРВ-терапію, то її вірусне навантаження може коливатися в широкому діапазоні
від одного тесту до іншого, при цьому подібні флуктуації не впливають на
здоров`я [5].
Визначення вірусного
навантаження здійснюється лабораторними методами діагностики ВІЛ-інфекції.
Специфічне лабораторне дослідження передбачає виявлення специфічних маркерів
ВІЛ в біологічному матеріалі пацієнта. До них відносяться: безпосереднє
виділення ВІЛ; визначення його структурних антигенів; визначення генетичного
матеріалу вірусу; визначення специфічних антитіл до ВІЛ.
До неспецифічних маркерів
відноситься наявність імунодефіциту, що з'ясовується проведенням комплексного
імунологічного дослідження крові з обов'язковим визначенням вмісту Т-лімфоцитів
хелперів (CD4+- клітин) [3].
Достовірність та помилки при лабораторному виявленні ВІЛ
Спеціальні набори
реактивів для виявлення маркерів ВІЛ є спеціальними діагностичними
тест-системами й найчастіше вони призначені саме для визначення антитіл до вірусу
за допомогою імуноферментного методу. Їх здатність виявляти максимальну
кількість «дійсно позитивних» сироваток крові визначає чутливість тест-системи,
а здатність реєструвати мінімальну кількість «хибно позитивних», тобто тих, що
дають помилкову реакцію, визначає специфічність тест-системи. Так, якщо
чутливість тесту складає 99,9%, то це означає, що він виявлятиме 999 сироваток
з кожних 1000, що містять антитіла до ВІЛ, а одну з тисячі не виявить. Якщо
специфічність заявлена як 99,9%, то це значить, що тест прореагує як
"позитивний" з однією з 1000 обстежених сироваток, у яких точно немає
антитіл до ВІЛ [1].
На практиці до цих
неминучих похибок додаються ще хибно негативні та хибно позитивні результати,
які виникають через помилки персоналу, через погіршення якості систем під час
їх невірного транспортування та збереження або при порушені термінів їх
використання. На результати тестування можуть впливати безліч інших факторів:
наприклад, наявність у пацієнта деяких хвороб (наприклад при сифілісі або корі
часто бувають хибно позитивні результати тестування). Навіть такі фактори, як
якість води, якою користуються для промивання лабораторного посуду, також має
значення [2].
Виявлення антитіл до ВІЛ
включає два етапи. У роботі припустиме використання лише ліцензійних
тест-систем, тобто тих, що мають дозвіл до застосування Міністерства охорони
здоров'я. Усі діагностичні процедури повинні проводитися лише відповідно до
затверджених інструкцій із застосуванням зазначених в ній тестів. Кров у
кількості 3-5 мл береться з ліктьової вени шприцом і вміщується в чисту суху
пробірку. Потім відокремлюється сироватка, яка переноситься в стерильну
пробірку чи флакон або пластиковий контейнер: в такому вигляді вона може
зберігатися до 7 днів при температурі 4-8°С [4, 6].
При одержанні першого
позитивного результату аналіз проводиться ще 2 рази (з тією ж сироваткою й у
тій же тест-системі). При одержанні хоча б ще одного позитивного результату
(два позитивних результати з трьох постановок) сироватка досліджується в іншій
тест-системі, обраної для підтвердження. При позитивному результаті аналізу і в
другій тест-системі сироватку направляють на дослідження в імунному блотінгу,
який дозволяє виявляти не сумарні антитіла до структурних компонентів ВІЛ, а
антитіла до окремих його антигенів, що часто дозволяє визначити не лише
наявність ВІЛ у пацієнта, але й певною мірою з'ясувати давність зараження.
Якщо в другій
тест-системі результат виявився негативним, сироватка досліджується в третій
тест системі. У випадку негативного результату аналізу і в другий, і в третій
тест-системі видається висновок про відсутність антитіл до ВІЛ, а при
позитивному результаті в третій тест-системі сироватка також направляється на
дослідження в імунному блотінгу [4].
Результати останнього
інтерпретуються, як позитивні, сумнівні і негативні. Позитивний результат
свідчить про наявність у досліджуваному матеріалі антитіл до ВІЛ, негативний –
про їх відсутність. При одержанні невизначеного (сумнівного) результату в
повному обсязі проводяться повторні дослідження на антитіла до ВІЛ через 3
місяці, і якщо сумнівні результати зберігаються – ще через 6 місяців. Якщо і
через 6 місяців знову будуть отримані невизначені результати, а у пацієнта
фактори ризику зараження і клінічних симптомів ВІЛ-інфекції не будуть виявлені,
результат розцінюється як хибно позитивний. Але при наявності епідеміологічних
і клінічних показань ці дослідження за призначенням лікаря повторюються через
певний час [1, 2].
Таким чином, на сьогодні
найбільш актуальними та розповсюдженими методами лабораторного дослідження на
ВІЛ є імуноферментний аналіз та полімеразна ланцюгова реакція. Кожен з них має
свої недоліки та переваги. Так, чутливість методу ПЛР становить лише 98%, що істотно нижче, ніж при використанні
імуноферментного аналізу (до 99,9%). Але перевага методу ПЛР полягає в тому, що
він здатний виявляти ВІЛ-інфекцію в інкубаційному і ранньому клінічному
періоді, коли антитіл ще може і не бути, а також він виявляється корисним для
прогнозування перебігу захворювання і оцінки ефективності терапії.
Література:
1.
Антиретровирусная терапия ВИЧ-инфекции у взрослых
и подростков: рекомендации с позиций общественного здравоохранения. – Женева:
Всемирная организация здравоохранения, 2010. – 176с.
2.
Антиретровирусная терапия при ВИЧ-инфекции у
взрослых и подростков. – Женева: Всемирная организация
здравоохранения, 2010. – 28с.
3.
Доступные иммунологические показатели для
динамического наблюдения и прогнозирования течения ВИЧ-инфекции / Л.В.
Серебровская, Д.И. Габрилович, Л.А. Иванова [и др.] // Мед помощь. – 1993. –
№5. – С. 46-48.
4.
Покровский В.В. Эпидемиология, лечение и
профилактика ВИЧ-инфекции и СПИДа / В.В. Покровский. – М: Медицина, 1996. –
248с.
5.
Расширение тестирования и консультирования на ВИЧ
как обязательный компонент мероприятий по обеспечению всеобщего доступа к
профилактике, лечению, уходу и поддержке при ВИЧ-инфекции в Европейском регионе
ВОЗ. – Женева: Всемирная организация
здравоохранения, 2010. – 36 с.
6.
Совместные рекомендации для служб
здравоохранения по проблеме ВИЧ/СПИДа. – Женева: Всемирная организация
здравоохранения, 2005. – 97с.
7.
Hepatotoxicity of nevirapine in virologically
suppressed patients according to gender and CD4 cell counts / E. de Lazzari, A.
Leon, J.A. Arnaiz [et al.] //
HIV Med. – 2008. – Vol. 9, №4. – P. 221-226.