Микитюк О.Ю., Шаплавський М.В.

Буковинський державний медичний університет, Україна

Фізичні основи проточної цитометрії та її застосування у медицині і біології

Проточна цитометрія є ефективним підходом до вирішення багатьох важливих завдань медицини, біології клітини та клітинної інженерії. Метод проточної цитометрії використовують для дослідження дисперсних середовищ в режимі поштучного аналізу елементів дисперсної фази за сигналами світлорозсіювання і флуоресценції. Основа методу полягає: у використанні системи гідрофокусування, яка забезпечує проходження клітин у потоці поодинці; опроміненні клітини лазерним випромінюванням; реєстрації сигналів світлорозсіювання і флуоресценції від кожної окремо взятої клітини в клітинній суспензії зі швидкістю до 3000 клітин в секунду.

Фізичні властивості клітин можуть бути виміряні на будь-якій окремій нефарбованій клітині. Клітини також можуть бути помічені специфічними барвниками, що зафарбовують ДНК, РНК або білок, або цілим набором флуорохром-кон'югованих антитіл, спрямованих до мембранних і внутрішньоклітинних компонентів клітин. В ході аналізу враховується як рівень флуоресценції хімічних сполук, що входять до складу клітини, так і внесених у зразок перед проведенням проточної цитометрії.

Суспензію попередньо забарвлених флуоресціюючими барвниками клітин під тиском проганяють через капіляр. Клітини, підхоплені потоком рідини, шикуються одна за одною, утворюючи "ланцюжок" - так здійснюється гідрофокусування, завдяки якому створюються умови ламінарного потоку без перемішування суспензії клітин з обтікаючою рідиною. Коли такий струмінь перетинає сфокусований лазерний промінь, то в точці перетину потоку і променя одночасно виявляється, як правило, тільки одна клітина, що дозволяє уникнути артефактів, пов'язаних з різною віддаленістю клітин від точки перетину лазерного променя з потоком.

У вимірювальній камері приладу молекули деяких клітинних структур, перетинаючи промінь монохромного лазера, поглинають світло певної довжини хвилі і переходять в збуджений стан. Повертаючись через короткий час в початковий стан, клітини випромінюють кванти світла з іншими довжинами хвиль. Це вторинне випромінювання, що має строго визначені для кожного виду клітин або їх структур довжини хвиль, проходячи через оптичну систему приладу реєструється фотоелектронним помножувачем, який перетворює його в електричні сигнали, зручні для комп'ютерної обробки та зберігання.

У момент перетину клітиною лазерного променя детектори фіксують: 1) розсіювання світла під малими кутами (від 1° до 10°), отримана характеристика використовується для визначення розмірів клітин; 2) розсіювання світла під кутом 90°, що дозволяє робити висновки про співвідношення ядро / цитоплазма, а також про неоднорідність і гранулярність клітин; 3) інтенсивність флуоресценції по декількох каналах флуоресценції (від 2 до 18-20) - дозволяє визначити субпопуляційний склад клітинної суспензії та ін.; 4) поляризацію флуоресценції і час прольоту частки, що дозволяє оцінити ступінь в’язкості клітинних мембран, яка змінюється в залежності від їх функціонального стану, а також ступінь асиметричності клітин чи досліджуваних органел.

Два або три флуоресцентних сигнали, кожен з яких свідчить про реакцію одного маркера зі специфічним розпізнаваним антигеном, можуть бути зафіксовані разом з сигналами переднього (FSC) і бічного розсіювання (SSC) світла. Сигнали розсіювання світла, що характеризують розмір клітини (FSC), а також цитоплазматичні і мембранні особливості (SSC), пов'язують результати флуоресцентного аналізу з морфологічно певними популяціями.

Мультипараметричний аналіз проточної цитометрії дозволяє зменшити необхідний обсяг біологічного матеріалу (до 100 мкл), час пробопідготовки і фактичного аналізу (секунди) за рахунок високої швидкості. Перевагою методу також є можливість аналізу великої кількість клітин (до 108 клітин); вимірюються параметри рідкісних клітин; відбувається об'єктивне вимірювання інтенсивності флуоресценції.

Методом проточної цитометрії досліджуються такі зразки: кров; кістковий мозок; ліквор; суглобова, плевральна та асцитична рідини; суспензійовані клітини тканин.

Розглянемо основні області застосування методу в медичній практиці.

Основним завданням проточної цитометрії в імунології є імунофенотипування нормальних і патологічних імунокомпетентних клітин, визначення фагоцитарної активності, внутрішньоклітинних цитокінів, внутрішньоклітинних білків, проліферативної активності, дослідження клітинного циклу, оцінка клітинної цитотоксичності, дослідження системи вродженого імунітету. Використання моноклональних антитіл, кон'югованих з різними флуорохромами, призвело до розвитку багатопараметричного аналізу і спростило роботу фахівців в діагностиці різних порушень імунної системи.

Проточна цитометрія в онкології – це кількісний аналіз ДНК; аналіз стадій клітинного циклу; виявлення анеуплоїдного клону та визначення його проліферативної активності; визначення специфічних маркерів; моніторинг пацієнтів, що входять до групи ризику; оцінка стану імунної системи, що полягає у оцінці клітинної ланки імунітету та функціональної спроможності імунокомпетентних клітин.

У сучасних нанонейротехнологіях перспективним є використання магнітних наночастинок для транспортування біологічно активних речовин і ліків до клітин-мішеней у разі зовнішнього маніпулювання та в протипухлинній терапії. Методами проточної цитометрії та фотонної кореляційної спектроскопії досліджується зв’язування наночастинок з нервовими терміналями та тромбоцитами. Розмір частинок у препаратах визначали за прямим (FSС), а цитоплазматичну гранулярність — за бічним (SSС) світлорозсіюванням.

В цитології метод використовується для визначення цитоморфологічної приналежності клітини; оцінки активності внутрішньоклітинних ферментів; визначення експресії поверхневих антигенів; для аналізу стадій клітинного циклу; виміру фізіологічних параметрів клітини - внутрішньоклітинного pH, концентрації вільних іонів Ca²⁺, потенціалу зовнішньої клітинної мембрани. Проточна цитометрія використовується для вивчення трансмембранного обміну іонів кальцію в мітохондріях, наприклад для виявлення змін мітохондріального потенціалу та рівня активних форм кисню тощо. Також метод використовується для вивчення обміну іонів Ca²⁺ в ізольованих мітохондріях.

Гематологія використовує даний метод для аналізу субпопуляційного складу клітин периферичної крові; підрахунку ретикулоцитів, аналізу тромбоцитів за специфічними маркерами; диференційної діагностики лімфопроліферативних захворювань і реактивних лімфоцитозів; діагностики гострих лейкозів; оцінки мінімальної резидуальної хвороби.

Проточна цитометрія застосовується для виявлення в досліджуваних зразках бактеріальних, грибкових і власних клітин організму людини (в кількості 10-100 штук в 1 мл крові); для визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів. Піддані впливу антибіотиків мікроорганізми (in vivo або in vitro) порівнюють з контрольними зразками того ж штаму для встановлення їх життєздатності, а також змін в нуклеїнових кислотах, білках, оболонці клітин і ін., що дозволяє оцінити ступінь ефекту антибіотика.

Метод дозволяє проводити моніторинг стану вірусного процесу у ВІЛ-інфікованих пацієнтів і може використовуватися для контролю ефективності проведеної терапії.

Проточна цитометрія може бути використана для вимірювання оксидативного стресу в соматичних клітинах у робітників, експонованих до зварювального пилу, та для інших виробничих середовищ. Рахування індексу оксидативного стресу є корисним для передбачення наслідків захворювань та для визначення ефективності профілактичних заходів.

Поява нових напрямків у проточній цитометрії відкриває широкі перспективи для подальшої ідентифікації пошкоджених або змінених клітин і дозволяє приймати адекватні рішення щодо ефективного лікування виявлених патологічних змін.