Индекс УДК: 616.831-005.1-056:616.12-008.331.1
ПЦР - ДИАГНОСТИКА У СПОРТСМЕНОВ
А.Ш. Орадова, Б.К. Дюсембаев.
Казахский Национальный медицинский университет им. С.Д.
Асфендиярова, г. Алматы.
Тұжырым
А.Ш. Орадова,Б.К. Дюсембаев.
СПОРТСМЕНДЕРДІҢ ПТР-
ДИАГНОСТИКАСЫ
Қәзіргі
заманда барлық популяцияларда төрт дәрежелі
факторлардың ЖТА дамуына маңызды қатерлер: а) негізгі
основные модифициялар (жөғарғы қан қысымы,
аномальды липидтық профилі, шылым тарту, гиподинамия, семіру,
жағымсыз тамақтану); б) басқа модифициялар
(социоэкономиялық статус, қөніл-күйдың
қысымының күшеюі, алкоголь, кей-бір дәрілер); в)
модифицияларға жатпайтың (жасы, этнос түріне жатуы,
тұқым куу, жынысы); г) жаңа түрлері деп аталған
(гипергомоцистеинемия, қабыну, аномальное қанның
қойылануы).
Резюме
А.Ш.,
Орадова,Б.К. Дюсембаев.
ПЦР-ДИАГНОСТИКА У СПОРТСМЕНОВ
В настоящее время во всех популяциях значимы четыре категории
факторов риска ССЗ: а) основные модифицируемые (высокое артериальное давление,
аномальный липидный профиль, курение, гиподинамия, ожирение, нездоровая диета);
б) другие модифицируемые (социоэкономический статус, эмоциональное
напряжение,алкоголь, определенные медикаменты); в) немодифицируемые (возраст,
этническая принадлежность, наследственность, пол); г) так называемые новые (гипергомоцистеинемия,
воспаление, аномальное свертывание крови).
Summary
A.
Sh. Oradova, B.K.Duyssembayev.
PCR - DIAGNOSTICS BESIDE
ATHLETES
At present in all populations
significant four categories of factors of risk CVD: а) main modified (high arterial pressure, anomalous lipid profile,
smoking, hypodynamia, obesity, unhealthy diet), b) other
modified (socioeconomical status, emotional voltage, alcohol, determined medication); c) no
modified (age, ethnic an attribute, heredity, sex) ; d) so-called new (hyperhomocysteinemia
inflammation, anomalous rolling up shelters)
В практике спорта главными ориентирами при
экспертных суждениях о возможном росте мастерства спортсмена служат
эффективность соревновательной деятельности и темпы прироста тренировочного
эффекта. Данные оценки часто не соответствуют реальной динамике спортивного
мастерства. Это связано с тем, что в определенный момент своей карьеры
спортсмен может достичь генетически лимитированного уровня развития
наследственного потенциала. Поэтому при спортивном отборе и прогнозе
генетические маркеры индивидуальных возможностей должны стать основными критериями наряду с оценкой
фенотипа человека. Предрасположенность человека к выполнению мышечной
деятельности обусловлено набором полиморфных генов, индивидуальных для каждого
человека, и уровнем их экспрессии, которая определяется не только
наследственностью, но и факторами окружающей среды [1,2,3].
Цель
исследования
Основной целью исследования явилось изучение
возможной ассоциации полиморфизма
нескольких генов с проявлением физической работоспособности у
спортсменов.
Материалы и методы
Геномная ДНК была выделена из эпителиальных клеток ротовой полости спортсменов. Критериями
отбора спортсменов служили следующие тесты: а) на выносливость: гребля на
“Концепте 11” – 12 мин (оценивалось пройденное расстояние и мощность) – тест 1,
модифицированный тест Купера – 2 км (оценивалось время выполнения и мощность) –
тест 2, модифицированный тест Купера на велоэргометре – 12 мин (оценивалось
пройденное расстояние) – тест 3; б) на силу: 10 максимальных гребков
(оценивалось время выполнения и мощность) -
тест 4. Кроме того, учитывался уровень спортивного мастерства: анализируемую группу атлетов составили 6
мастеров спорта, 26 кандидатов в мастера спорта и 24 спортсмена, имеющих 1
разряд.
Методом
полимеразной цепной реакции и анализом полиморфизма длины рестрикционных
фрагментов исследован полиморфизм исследуемых пяти генов: ACE (I/D), AGT
(M235T), AGT2R1 (A1166C), VDR
(Taq1 полиморфизм), ecNos (27 п.н. повтор) в
группе спортсменов (гребцы, N=56, мужчины) и в
контрольной выборке (индивидуумы среднего возраста, N=26, мужчины).
Смесь для
амплификации объемом 25 мкл включала 67
мМ трис-НСI, рН 8.8 при 25оС; 16.6 мМ (NH4)2SO4; 6.7 мМ MgCI2; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ
2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0
мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 0,2 ед/мкл и по 0,001 оптической единицы
каждого олигопраймера. Для амплификации использовали программируемый
термоциклер фирмы “Bio-Rad” (USA) или
ДНК-амплификатор фирмы “ДНК-технология” (Россия).
Для амплификации
фрагментов генов ACE (F: 5'-CTGGAGA CCACTCCCATCCTTTCT-3, R:
5'-ATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3) и ecNos (F:
5'-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3', R: 5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3') использовали
следующие условия ПЦР: предварительная денатурация 940С (7мин), 30
циклов амплификации: 940С (1мин), 620С (1мин), 720С
(1мин 10сек). Заключительный синтез 72оС - 5 мин. Размер ПЦР
продукта гена АСЕ: I аллель - 477 п.о. и D аллель - 190 п.о.; гена
ecNos: “4” аллель - 370 п.о. и “5” аллель - 397 п.о.
Для
амплификации фрагмента гена VDR (F:
5'-GATGATCCAGAAGCTAG CCGACCT -3, R: 5'- GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCT -3)
использовали следующие условия ПЦР: предварительная денатурация 940С
(7мин), 30 циклов амплификации: 940С (1мин), 580С (1мин),
720С (1мин 30сек). Заключительный синтез 72оС - 5 мин.
Ферментативный гидролиз ПЦР продукта
гена VDR эндонуклеазой Taq1 (Сибэнзим) проводили
при 65оС в течение 3 ч в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл
ПЦР продукта, 1мкл 10Х буфера (рекомендованного производителем) и 5 ед.
рестриктазы Taq I. Размер ПЦР продукта гена VDR: T
аллель - 360 п.о. и t аллель - 248 п.о. и 112 п.о.
Для
амплификации фрагмента гена AGT (F: 5'- CCGTTTGTGCAGGG CCTGGCTCTC-3, R: 5'- CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC-3) использовали следующие условия ПЦР:
предварительная денатурация 940С (7мин), 10 циклов амплификации: 940С
(1мин), 680С (1мин), 720С (1мин) и 18 циклов
амплификации: 900С (30сек), 680С (1мин), 720С
(30сек). Заключительный синтез 72оС - 10 мин. Ферментативный
гидролиз ПЦР продукта гена AGT
эндонуклеазой TthI111 (Сибэнзим) проводили при 65оС в течение 6 ч в
10 мкл реакционной смеси, содержащей 7 мкл ПЦР продукта, 1мкл 10Х буфера
(рекомендованного производителем) и 10 ед. рестриктазы TthI111. Размер ПЦР продукта
гена AGT: T аллель - 165 п.о. и M
аллель - 139 п.о. и 26 п.о.
Для
амплификации фрагмента гена AGT2R1
(F: 5'- CACCATGTTTTGAGGTTGAGTGACA-3, R: 5'-AAAGTCGGTTCAGTCCAC ATAATGC-3) использовали
следующие условия ПЦР: предварительная денатурация 940С (7мин), 40
циклов амплификации: 940С (1мин), 570С (1мин), 720С
(1мин). Заключительный синтез 72оС - 7 мин. Ферментативный
гидролиз ПЦР продукта гена AGT2R1
эндонуклеазой BstDE1 (Сибэнзим) проводили при 60оС в течение 3 ч в
10 мкл реакционной смеси, содержащей 3 мкл ПЦР продукта, 1мкл 10Х буфера
(рекомендованного производителем) и 10 ед. рестриктазы BstDE1 . Размер ПЦР продукта
гена AGT2R1: A аллель - 165 п.о. и C
аллель – 103 п.о. и 62 п.о.
После
амплификации и рестрикции продукты реакции анализировали электрофорезом в 6,0%
полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в
проходящем УФ на трансиллюминаторе “Bio-Rad”
(USA).
Определение достоверности различий популяционных
частот производили методом χ2
по стандартной формуле (Microsoft Excel).
Результаты и обсуждение
При исследовании
генетического полиморфизма (ACE (I/D
полиморфизм), AGT (M235T), AGT2R1 (A1166C), VDR
(Taq1 полиморфизм), ecNos (27 п.н. повтор)) в
группе гребцов и в контрольной группе нами выявлены различия в частотах
генотипов данных генов между этими двумя выборками. Показано достоверное
увеличение частоты генотипа T/M
гена AGT в группе гребцов (68%)
по сравнению с контрольной группой (31%)(р<0,01). Также обнаружено возрастание частот
генотипа I/D
(АСЕ), генотипа А/А (AGT2R1),
генотипа 4/5 (ecNos) и генотипа t/t (VDR)
в группе гребцов (57%; 57%; 37,5%; 19,7%
соответственно) по сравнению с
контрольной выборкой (35%; 39%; 31%; 12% соответственно). Однако данные
различия статистически не достоверны.
При сравнительном анализе частот генотипов
исследованных генов между группами спортсменов разной квалификации и
контрольной выборкой выявлено увеличение показателей силы и выносливости у
высококвалифицированных спортсменов, имеющих генотип T/M
гена AGT. Показано снижение частоты данного генотипа в ряду
высококвалифицированные спортсмены (I) - квалифицированные
спортсмены (II) - контроль (III). Частота T/M
генотипа в данном ряду при анализе тестов на выносливость составила:
91%-50%-31%, соответственно для каждой из групп (1 тест), 80%-56%-31% (2 тест), 80%-67%- 31% (3 тест) и 83%-55%-31%
при анализе теста 4 (на силу). Для генотипов других генов подобных ассоциаций
выявлено не было.
Выводы
В заключении следует отметить, что научные
поиски необходимо проводить не только в направлении увеличении списка генов,
обуславливающих развитие физических качеств, но и расширения понимания роли
каждого гена в адаптации организма к мышечной нагрузке.
ЛИТЕРАТУРA
1. Рогозкин В.А.
Расшифровка генома человека и спорт // Теория и практика физической
культуры. 2001. N.
6. С. 60-63.
2.
Nazarov I.B., Woods D.R., Montgomery
H.E., Shneider O.V., Kazakov V.I., Tomilin N.V., Rogozkin V.A. The angiotensin
converting enzyme I/D polymorphism in Russian athletes // Eur. J. Hum. Genet.
2001. V. 9. P. 797-801.
3.
Tajima O., Ashizawa N., Ishii T.,
Amagai H., Mashimo T., Liu L.J., Saitoh S., Tokuyama K., Suzuki M. Interaction
of the effects between vitamin D receptor polymorphism and exercise training on
bone metabolism // J. Appl. Physiol. 2000. V. 88. P. 1271-1276.
старший научный сотрудник
Научно-образовательной лаборатории
КазНМУ, к.м.н. Орадова А.Ш.
тел: 279-67-79, 87017135158, e-mail: www.oradova@.ru
доцент кафедры скорой и неотложной
медицинской помощи
КазНМУ Дюсембаев Б.К.
тел: 279-67-79, 87013557222, e-mail: www.bika2@inbox.ru