К.вет.н., доцент Бибен И.А.

Днепропетровский государственный аграрно-экономический университет, Украина

Лиофилизация пробиотической культуры Bac. subtilis BI-12

Пробиотики – это культуры живых микроорганизмов и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина через оптимизацию и стабилизацию его микробиоты [5,1,2]. Сенные бациллы с выраженными пробиотическими потенциями являются перспективными микробионтами для заместительной терапии и коррекции дисбиозов внутренней среды макроорганизма. В отличие от антибиотиков и химиотерапевтических препаратов пробиотические культуры не оказывают негативного воздействия на представителей нормальной микрофлоры покровных тканей макроорганизма, а при дисбиотических процессах стимулируют восстановление качественного и количественного состава резидентных микробиоценозов [1-4].

Нами были изолированы из объектов внешней среды и апробированы на цыплятах с положительным результатом две биологически равноценные пробиотические культуры Bac. subtilis штаммы BI-07 и BI-12. Но при длительном использовании бактериальных культур в процессе частых пересевов неизменно возникают диссоциативные явления, приводящие к морфологическим, культуральным и биохимическим модификациям, приводящим к потере первоначальных полезных биологических свойств и накоплению отщепленных дочерних мутантных форм с измененными характеристиками [1,2,6,7]. Поэтому целью работы было разработать методику длительного сохранения исходных нативных качеств материнской расплодки пробиотической культуры сенных бацилл на модели штамма BI-12.

После сравнительного изучения наиболее широко применяемых в лабораторной практике методов консервации исходных биологических свойств культур микроорганизмов мы остановились на лиофилизации и разработали регламент сублимационного высушивания применительно к сенным бациллам с пробиотическим свойствами.

Технологическими особенностями подготовительного этапа сублимационного высушивания спороносных микроорганизмов является получение стандартизированного спорового материала. Для этого использовали элективную питательную среду агар Гаузе №2 в биологических матрацах в процессе накопления споровой биомассы культуры пробиотика в лабораторных условиях. Перед посевом определили исходные качества пробиотической культуры. Сенные бациллы обладали характериными для вида морфо-тинкториальными и культуральными свойствами, характеризовались перитрихиальным типом подвижности, способностью утилизировать глюкозу, ксилозу, маннит, сахарозу, мальтозу, гидролизовать эскулин и крахмал, не утилизировали лактозу и салицин, не образовывали газ при расщеплении глюкозы, росли на средах в присутствии 7 % NaCl и цитрата, восстанавливали нитраты, не продуцировали индол, сероводород и фермент уреазу, не утилизировали пропионат, гидролизировали крахмал и казеин, а также разжижали 10 % желатину, патогенных свойств не зафиксировано (не обладали факторами патогенности (гемолитической и лецитиназной активностью). Пробиотическая культура в тесте антимикробной активности методом отстроченного антагонизма показала, что обладает высоким уровнем антагонистической активности в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Для получения спорового материала в биоматрацы со скошенной питательной средой Гаузе №2, после удаления конденсата вносили предварительно прогретую при 70 ^оС в течение 20 мин пробиотическую культуру сенных бацилл с посевной дозой не менее 10⁶ микробных клеток/см³, которую затем равномерно распределяли по поверхности агара.

Культуру выращивали при 37 ^оС в течение 4 суток, затем готовили препараты-мазки, окрашивали по Циль-Нильсену и микроскопировали в иммерсионной системе светлопольного микроскопа. При этом оценивали завершенность процесса спорообразования, типичность морфологии спор и отсутствие посторонней микрофлоры. После завершения стадии спорообразования из матрацев с кондиционной споровой культурой удаляли конденсат и стерильным изотоническим раствором поваренной соли смывали ее с поверхности питательной среды.

Подготовленную микробную культуру пробиотика стандартизировали по ряду показателей качества, а именно: общая концентрация клеток при подсчете в камере Горяева; концентрация жизнеспособных клеток; антагонистическая активность, биохимические характеристики; количество зрелых спор; термоустойчивость спор. Определение комплекса этих показателей позволяет объективно и достоверно оценить кондиционность спорового биоматериала пробиотика при решении вопроса о возможности лиофилизации и дальнейшего сравнения полученного продукта с исходными характеристиками.

В качестве защитной среды использовали сахарозо-желатинозу с содержанием действующих ингридиентов по 3 % каждого. Вместо традиционной жилатины использовали модифицированный вариант – гидролизиванный при жестком автоклавировании препарат. Готовую среды фильтровали, разливали во флаконы, дробно стерилизовали при щадящем температурном режиме, контролировали нейтральное значение рН. Суспензию спор со средой высушивания в соотношении 1:1 разливали в ампулы, замораживали в смеси твердой углекислоты с этиловым спиртом до температуры минус 60 ^оС, затем помещали в вакуумный аппарат и высушивали при остаточном давлении 10 Па. Остаточная влажность высушенного биоматериала не превышала 3 %. При сравнительном исследовании биологические качества пробиотика не изменились при сохранности 80 % от исходной концентрации. Хранили препарат при 4 ^оС в течение года. По истечении указанного срока концентрация уменьшилась статистически несущественно при неизменности исходных биологических характеристиках пробиотической культуры в споровой форме.

Заключение. Оптимальным методом длительного сохранения нативных биологических качеств пробиотической культуры сенных бацилл является лиофилизация с последующей реактивацией для применения в производственной технологической цепочке выращивания молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.

Литература:

1. Осипова И.Г. Споровые пробиотики / И.Г. Осадчая, Н.А. Михайлова, И.Г. Сорокулова и др. [Текст] // Журн. микробиол. – 2003. - № 3. – С. 113-119.

2. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов / И.Б. Сорокулова [Текст] // Антибиотики и химиотерапия. – 1996. – Т. 41, № 10. – С. 13-15.

3. Bansal S. Probiotics in health and diseasts / S. Bansal [Text] // J. Assoc. physicians. – 2001. - № 7. – Р. 734-741.

4. Buchell M.E. A physiological model for of erythromycin production in bath and cyclyc fed bath culture / M.E. Buchell, J. Smith, H.C. Lynch [Text] // Microbiology. – 1997. – Vol. 143, № 2. – Р. 475-480.

5. Collins M.D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins, G.R. Gibson [Text] // Am. J. Clin. Nutr. 1999 – Vol.69 (5). – Р. 1052 – 1057.

6. Factorial correspondence analysis of fear-related behavior traits in Japanese quail / S. Mignon-Grasteau, O. Roussot, C. Delaby et al. // Behaviour Processes. – 61(1-2). – 2003. – P. 69-75.

7. Kerti A. Content of retinol and retinyl esters in blood plasma, liver, kidney and reproductive organs of Japanese guails / A. Kerti, I. Buchholz, F.J. Schweigert [Text] // Acta Vet. Huhg. – 50(4). – 2002. – P. 435-443.