Тржецинський С.Д., Мозуль В.І., Д΄яченко А.Ю.

Запорізький державний медичний університет

ВИЗНАЧЕННЯ ВІТАМІНУ К ТА КОАГУЛЯЦІЙНОЇ АКТИВНОСТІ ДЕРЕВІЮ СТИСНУТОГО

Актуальним завданням фармакогнозії є розширення сировинної бази та створення нових високоефективних лікарських засобів кровоспинної дії. Перспективними об′єктами для фітотерапії є представники роду Achillea L., які використовуються у народній медицині багатьох країн як кровоспинний засіб. Рівень вивчення поліморфних видів роду Achillea L., які ростуть в межах України, недостатній. В науковій медицині деревій звичайний (Achillea millefolium L.) застосовується як кровоспинний, протизапальний, жовчогінний, шлунковий засіб [1,2]. Квіткові кошики і листя деревію багаті вітамінами K, C, дубильними речовинами, ефірними оліями, фітонцидами і каротином. Завдяки поєднанню таких біологічно активних речовин, рослина застосовується при лікуванні виразки шлунка, туберкульозу легень, малярії, нирковокам'яної хвороби, захворювань печінки, нервових захворювань, гіпертонії [2,3]. Застосування соку деревію як кровоспинного препарату не обмежується зовнішніми ранами, він ефективний і при внутрішніх кровотечах, таких, як маткові, носові, шлунково-кишкові, легеневі. Одне з важливих властивостей деревію – здатність до впливу на венозну стінку. Ось чому ця трава широко застосовується при лікуванні варикозного розширення вен [3]. Фізіологічна роль вітаміну К пов′язана з утворенням протромбіну і припиненням кровотеч.

До теперішнього часу сировина деревію стиснутого (Achillea stricta Schleich.) не є офіцінальною, тому важливим залишається всебічне фітохімічне та фармакологічне дослідження цього виду і виявлення додаткових джерел лікарської рослинної сировини для визначення можливості їх використання в медицині.

Метою роботи є визначення якісного складу, кількісного вмісту вітаміну К та визначення коагуляційної активності олійного екстракту трави деревію стиснутого.

Матеріали та методі дослідження

Підтвердження наявності вітаміну К в рослинній сировині проводили методом тонкошарової хроматографії на пластинках SILUFOL–254 в системах розчинників: циклогексан – ефір (8:2) та гексан – ефір – льодяна оцтова кислота (90:10:1). Висушені хроматограми проявляли 5% розчином фосфорно-молібденової кислоти, утворювались оранжево – червоні плями.

Кількісний вміст вітаміну К в траві деревію стиснутого визначали спектрофотометричним методом на спектрофотометрі «СФ-46» при довжині хвилі 265 нм у кюветі з шаром завтовшки 10 мм. Паралельно вимірювали оптичну густину робочого стандартного зразка вікасолу.

Методами дослідження коагуляційної активності екстракту трави деревію стиснутого було обрано проведення протромбінового та активованного часткового тромбопластинового часу (АЧТЧ), у зв’язку з тим, що завдяки цим тестам, можливо діагностувати патології згортаючої системи крові та вплив на гомеостаз організму в цілому.

Для підтвердження наявності вітаміну К в олійному екстракті трави деревію стиснутого була обрана токсична модель гепатиту, при якому порушується протеосинтетична функція печінки, зменшується вміст плазмових факторів згортання крові. Додавання вітаміну К гальмує цей процес [4].

Для відтворення патології токсичного гепатиту використовувався ізоніазид, який самостійно вводили щурам внутрішньочеревинно в дозі 100 мг/кг маси тіла щодня протягом 14 діб. Досліджувані речовини та препарати порівняння вводились з 8-го по 14-й день досліду.

Протромбіновий час визначали за допомогою коагулометра. Вимірювали час утворення фібрину в плазмі крові в присутності іонів кальцію і тканинного тромбопластину (тромбопластин-кальцієвої суміші) [6].

Протромбіновий індекс розраховували, як відношення часу, який необхідний для згортання зразка плазми до часу, який витрачено на згортання контрольного зразка. Отримана величина вимірювалась у відсотках [5].

Для визначення протромбінового тесту у пробірку з 0,5 мл 3,8% розчином цитрату натрію додавали 4,5 мл крові. Отриману суміш центрифугували при 3000 об/хв 15 хв в центрифузі. В окрему пробірку зливали отриману плазму. Досліджувану плазму в об'ємі 0,1 мл, прогрівали в пробірці на водяній бані (або кюветі коагулометра) при +37°С. Через 30 с додавали 0,2 мл прогрітої до +37°С тромбопластин-кальцієвої суміші (0,1 мл тромбопластину та 0,1 мл 0,277% розчину хлориду кальцію). Включали секундомір і визначали час згортання. Таке ж визначення проводили і для контрольної нормальної плазми. Час згортання реєстрували у секундах.

Визначення протромбінового часу у крові проводили на коагулометрі з механічним принципом реєстрації результатів (коагулометр Тромбостат-2, фірми Behnk Electronik, Німеччина). Реактиви для проведення протромбінового тесту використовувались з набору «Техпластин - тест» у склад якого входять тромбопластин, розчинник для тромбопластину, цитрат натрію, контрольна плазма.

Результати досліджень Методом тонкошарової хроматографії було встановлено наявність в сировині деревію стиснутого вітаміну К. Кількісний вміст визначали спектрофотометричним методом на спектрофотометрі «СФ-46» при довжині хвилі 265 нм. Вміст вітаміну К в перерахунку на абсолютно суху сировину дорівнює 2,176 ± 0,085% .

Вагому роль в підтримці гомеостазу відіграє вітамін К, який, як відомо, приймає учать в якості Со-фактору в ферментативних системах відповідальних за синтез протеїнів – плазмових факторів згортання крові. При його дефіциті порушуються процеси згортання і настає гіпокоагуляція.

Протромбіновий тест є одним з найбільш розповсюджених аналізів в коагулогії. Він імітує зовнішній шлях згортання крові, коли з тканин при пошкодженні виділяється так званий тканинний фактор, ліпопротеїн, який пов'язаний з клітинною мембраною. Протромбіновий тест використовується для скринінгового дослідження згортаючої системи, моніторингу терапії тромбозів, діагностики захворювань печінки, виявлення дефіциту вітаміну К.

Визначення активованного часткового тромбопластинового часу (АЧТЧ)– це базова методика для дослідження системи гомеостазу. Цей тест виявляє плазмові дефекти внутрішньої системи активації X фактору в першій фазі згортання крові. Збільшення АЧТЧ відображає дефіцит плазмових факторів і спостерігається при їх значному зниженні, а також вказує на гіпокоагуляцію. Зменшення АЧТЧ свідчить про гіперкоагуляцію і відмічається в першій фазі гострого ДВЗ – синдрому [4]. Визначення АЧТВ, поряд з іншими тестами, використовується в діагностиці синдрому внутрішньо судинного згортання. В тесті визначається час зсідання плазми крові в умовах стандартизованої контактної (каоліном) і фосфоліпідної (кефаліном) активації процесу в присутності іонів кальцію.

Таблиця 1

Вплив олійного екстракту деревію стиснутого на показники згортаючої системи крові у піддослідних тварин в умовах експериментального токсичного гепатиту, (Х±S_х), n=6

Препарат, група	Інтактна група	Контроль (Ізоніазид)	Група № 3 (Ізоніазид + вікасол)	Група № 4 (Ізоніазид +екстракт деревію)
ПЧ, с	13 ± 0,18	16,866 ± 0,36	15,45 ± 0,28	13,266 ± 0,42
ПЧ, с	13,166 ± 0,17	16,833 ± 0,34	15,133 ± 0,18	13,65 ± 0,42
ПІ, %	104,666 ± 1,20	135,833 ± 2,94	121 ± 1,90	109,333 ± 3,16
АЧТЧ, с	25,616 ± 0,25	59,633 ± 4,27	29,216 ± 1,31	31,866 ± 1,14

Результати досліджень (таблиця 1) показали, що в групі тварин з токсичним гепатитом значно підвищується протромбіновий час, протромбіновий індекс та активований частковий тромбопластиновий час (АЧТЧ), що свідчить про нестачу плазмових факторів згортання крові. Введення олійного екстракту деревію стиснутого призвело до нормалізації показників згортання крові, які досліджувались. При цьому протромбіновий час, протромбіновий індекс та АЧТЧ в цій групі тварин знизились до показників інтактної групи та зрівнялись з показниками групи тварин, яким вводили вітамін К. Таким чином отримані показники свідчать про відновлення вмісту плазмових факторів згортання крові за рахунок посилення синтезу їх в гепатоцитах, що підтверджує наявніть вітаміну К в олійному екстракті деревію стиснутого.

Висновки

1. Методом протромбінового тесту та АЧТЧ досліджена коагуляційна активність олійного екстракту трави деревію стиснутого. Отримані показники свідчать про відновлення вмісту плазмових факторів згортання крові за рахунок посилення синтезу їх в гепатоцитах, що підтверджує наявніть вітаміну К в олійному екстракті.

2. Проведено фармакологічне дослідження деревію стиснутого та доведено перспективність його використання для розширення сировинної бази лікарських рослин флори України, які мають кровоспинну дію.

Література

1. Кьосев П.А. Лекарственные растения: самый полный справочник / П.А. Кьосев. – М.:Эксмо, 2011.-944 с.

2. Лебеда А.Ф. Лекарственные растения: Самая полная Энциклопедия/ А.Ф. Лебеда, Н.И. Джуренко, А.П. Исайкина, В.Г Собко. .- М.: АСТПРЕСС КНИГА, - 2006. – 912 с.

3. Лекарственные растения [Електронний ресурс] //– Режим доступу до ресурсу:http://fitopedia.com.ua/rastenia-tisyachelistnik-vidi.html

4. Методы исследования коагуляционного гемостаза [Електронний ресурс]//–Режимдоступу до ресурсу:http://www.extramedicine.ru/tuns-185-1.html

5. Протромбиновое время [Електронний ресурс] //– Режим доступу до ресурсу:http://www.hemostas.ru/society/publications/p11.shtml.

6. Протромбиновый индекс [Електронний ресурс]//– Режим доступу до ресурсу:http://www.probirka.org/biblio/polezno/5303-analiz-krovi-na-protrombinoviy-indeks.html