Биологические
науки/5. Молекулярная биология
Чайка
С.О., Чайка И.А.
ФГБОУ
ВО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России, кафедра
общей и клинической биохимии №1, Ростов-на-Дону, Россия
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ КЛЕТОК И
ТКАНЕЙ В ФОРМАТЕ MALDI-TOF ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МАРКЕРОВ ПАТОЛОГИИ
Ключевые слова:
масс-спектрометрия, MSP-peak-list, протеомные маркеры, MALDI-TOF
Внедрение современных
методов биохимии и молекулярной биологии является пусковым механизмом
формирования нового взгляда на инфекционные и соматические процессы, их
экстренную диагностику. Наиболее интересным современным направлением является
изучение протеома клеток и тканей с помощью MALDY-TOF масс-спектрометрии. Технология
позволяет получить уникальные для изучаемого объекта масс-спектры, являющиеся
его метаболическими отпечатками пальцев, отражающими первичный транскрипт рибосомальных белков клеток [1, 2].
Регистрируемый в масс-спектрах белковый профиль дает возможность прямого
наблюдения транслированной последовательности ДНК на основе измерения спектра
молекулярных масс объекта, что сравнимо с методом мультилокусного
секвенирования [3, 4].
Прибор масс-спектрометр
представляет собой конвергенцию наук – физики, химии, биологии, которые в
комплексе решают биохимические и микробиологические задачи. Метод
масс-спектрометрии основан на разделении белков в вакууме по их подвижности. Раствор
матрицы, который представляет собой смесь органических кислот -
α-цианогидроксикоричной, ацетонитрила и трифторуксусной кристаллизуют изучаемый
объект. Его наносят на планшет, называемый MSP- чип и помещают в масс-спектометр.
Под действием электрического поля активируется лазер, который разбивает аналит
на его молекулярные составляющие. Разбитые молекулы вскипают и попадают в
вакуум времяпролетный анализатор Time of Fly (или
TOF).
Легкие ионы летят быстрее, тяжелые – медленнее. Они ударяются о детектор в
разное время. Их удары оцифровываются, каждому из них присваивается
(масс-заряд), по времени пролета. В результате образуется спектр молекулярных
масс белков клетки или ткани. Этот принцип лежит в основе видовой идентификации
микроорганизмов. Коммерческая база данных, поставляемая в комплектации с
программным обеспечением прибора содержит 5000 видов белковых спектров
микроорганизмов. Спектр изучаемого
микроорганизма в линейном режиме программного обеспечения сравнивается со
спектрами базы данных. По степени совпадений молекулярных масс оценивают показатель
«Score»
- степень достоверных совпадений, в диапазоне от 0 до 3. Значения 2.300-3.000 – указывает на высокую надежность
идентификации вида; 2.000-2.299– на идентификацию рода и возможную
идентификацию вида, значения 1700-1.999– на возможную идентификацию рода, менее
1.700– невозможность идентификации, в случае если этого микроорганизма нет в
базе данных [1, 2, 3, 4, 5]. Таким образом, осуществляется полная замена
длительной схемы микробиологической лабораторной диагностики.
Однако наибольший
интерес для изучения представляют те патогенные микроорганизмы, которые не
входят в коммерческую базу данных. Обычно это коллекции живых представителей
коллекций внутри вида, выделенные из разных объектов, в разные годы возникновения
эпидемических вспышек.
Методы генетического
анализа дают информацию о микроорганизмах внутри вида по наличию генов токсинобразования,
пилей адгезии, островков патогенности, что в формате масс-спектрометрии дает
возможность изучать протеомные маркеры транскрипции генов вирулентности. А
самое главное, создавать персонифицированные виртуальные музеи возбудителей
инфекционных заболеваний, которые в дальнейшем можно изучать в формате
компьютерного анализа, что выводит на принципиально новый уровень соблюдения
требований биологической безопасности.
Так, нами было получено
3 авторских базы данных протеомных коллекций микроорганизмов: 1. Белковые
профили масс-спектров представителей V.
cholerae. 2. База данных
масс-спектрометрических профилей клинических изолятов E.coli. 3. Белковые профили масс-спектров
представителей изогенных вирулентных и авирулентных вариантов Francisella tularensis.
В каждую базу данных
заложены не менее 100 протеомных профилей каждого вида, охарактеризованных по
таксономической принадлежности, генетической характеристике; по дате и месту
выделения, что позволяет продолжать проводить научно-поисковую работу, пользуясь
исключительно программным обеспечением компьютеров.
MALDY-TOF масс-спектрометрия
относится к числу современных постгеномных технологий, дающих представление о
совокупности белков на тканевом уровне, что создает качественно новые
возможности для системных поисков молекулярных маркеров патологического
процесса, например, при геникологических исследованиях.
Нашими коллегами из
института акушерства и педиатрии (Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Линде В.А. 2015
г.) изучен протеомный профиль плаценты при физиологической беременности,
преэклампсии и задержке роста плода. Исследования проводили с помощью двумерного
электрофореза и времяпролетной (MALDY-TOF) масс-спектрометрии, что позволило
идентифицировать белки с различными регуляторными свойствами, интенсивность
продукции которых при осложненной беременности отличается от физиологической.
Объектом исследования служили послеродовые плаценты. Плацентарную ткань
разгоняли с помощью 2Д электрофореза, получали аналитические гели, в которых
белковые пятна были окрашены азотнокислым серебром; белковые пятна вырезали,
подвергали трипсинолизу и помещали в MALDY-TOFмасс-спектрометр.
Полученные спектры каждого белкового пятна сопоставляли с базами данных NCBY и Sioiss-Prot с помощью программного пакета PD Quest («Bio-Rad», США). Таким образом были
идентифицированы белки с различными функциями и свойствами, обеспечивающими
возможность многосторонней регуляции метаболизма плаценты. Этот процесс
называется фингерпринт, когда этап протеомного анализа переходит в этап
метаболических характеристик полученного спектра. Это происходит с помощью
сопоставления полученных протеомных профилей с базой данных спектров
охарактеризованных белков с известной функцией [6].
В настоящее время нами
проводится работа по биохимическому анализу протеома свежевыделенных
клинических штаммов эшерихий. Нами установлены маркерные белки отличающие
гемолитическую вирулентную популяцию, вызывающую дискинезию желчевыводящих
путей, от негемолитической, что позволяет без постановки чашечного метода по
наличию пика c
m/z 9000 Да идентифицировать эшерихии,
вызывающие дисфункциональные нарушения желчевыделительной системы. Установлено,
что при восстановлении функционирования желчевыделительной системы,
гемолитический признак у эшерихий исчезает, что соответствует исчезновению пика
с m/z 9000 Да и появлению
негемолитических форм с доминирующим комплексом белков, имеющих m/z – 5700 Да [3].
В настоящее время все
полученные спектры баз данных подвергаются дальнейшему изучению по выявлению
маркеров транскрипции, представляющих диагностическую ценность и интерес в
плане патогенеза.
Все вышеизложенное
показывает эффективность создания баз данных протеомных клеток
прокариотического и эукариотического происхождения в формате MALDY-TOF, что позволяет по новому подойти к
оценке тяжести заболеваний при помощи молекулярной диагностики и компьютерного
анализа.
Список
литературы:
1.
Бочарова Ю.А., Чеботарь И.В., Маянский Н.А.
Возможности, проблемы и перспективы масс-спектрометрических технологий в
медицинской микробиологии (обзор литературы). Клиническая лабораторная
диагностика. 2016 -Т.61. №4.: 249-256
2.
Телесманич
Н.Р., Гончаренко Е.В., Чайка С.О., Чайка И.А., Теличева В.О. Возможности применения MALDI-TOF масс-спекрометрии для изучения
углевод - специфических рецепторов диагностического бактериофага эльтор. Журнал
микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; №2: 85-90
3.
Гапон М.Н., Телесманич Н.Р.,
Терновская Л.Н., Чайка С.О., Чайка И.А., Микашинович З.И.,
Твердохлебова Т.И. Времяпролетная масс-спектрометрическая внутривидовая
диагностика штаммов эшерихий, выделенных от человека. Клиническая лабораторная
диагностика. 2016- Т.61. №6. :371-374
4.
Телесманич Н.Р., Чайка С.О.,
Чайка И.А., Гончаренко Е.В., Ломов Ю.М. Масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF в
идентификации и типировании штаммов холерных вибрионов. Клиническая
лабораторная диагностика. 2016 -Т.61.
№6.: 375-379
5.
Миронова Л.В., Басов Е.А.,
Афанасьев М.В., Хунхеева Ж.Ю. MALDI-TOF
масс-спектрометрический анализ с молекулярно-генетической идентификацией Vibrio spp. в системе
мониторинга вибриофлоры поверхностных водоемов. Эпидемиология и инфекционные
болезни. Медицина: 2014 -Т.19.
№6.: 27-36
6.
Погорелова Т.
Н., Гунько В. О., Линде В. А. Протеомный спектр плаценты при осложненной
беременности // Фундаментальные исследования . 2015. №1-5.