Бойко І.О.,студент, Жерносєкова І. В., к.б.н.,Черевач Н. В., к.б.н., доцент

Дніпродзержинський державний технічний університет

Дніпропетровський національний університет ім.О. Гончара

ДОСЛІДЖЕННЯ КОНВЕРСІЇ КРОХМАЛЮ АМІЛОЛІТИЧНИМИ ФЕРМЕНТАМИ СТРЕПТОМІЦЕТУ

В останні роки розширюються можливості використання мікроорганізмів як біотехнологічних джерел промислово важливих ферментів. Крохмальдеградуючі ферменти, зокрема амілази, привертають увагу дослідників завдяки їх технологічній важливості й економічній вигідності. Вони характеризуються широким спектром застосування в різних галузях і становлять близько 30% світової продукції ферментів [1].  Особливості технологічних процесів у багатьох промислових виробництвах, де використовують амілази, потребують використання ферментних препаратів, які були б стійкими до підвищених температур і здатними гідролізувати сировину при високих температурах..  Виходячи з вищесказаного, особливо актуальним є дослідження процесу біосинтезу  термостабільних амілолітичних ферментів штамами бактерій – продуцентів біологічно-активних речовин.

Метою роботи було вивчення накопичення амілолітичних ферментів штамом бактерій Streptomyces recifensis var. lyticus 2Р-15 при вирощуванні в глибинних умовах.

В ході виконання роботи було досліджено динаміку синтезу амілолітичних ферментів при вирощуванні штаму Streptomyces recifensis var. lyticus 2Р-15 в глибинних умовах; вивчено спрямований синтез амілолітичних ферментів при індукції шляхом внесення у ферментаційне середовище різних концентрацій крохмалю; підібрано умови культивування штаму мікроорганізму для отримання максимального виходу ферменту; досліджено рівень накопичення біомаси штамом стрептоміцету при додаванні у середовище різних концентрацій крохмалю.

В процесі культивування на ферментаційному середовищі продуцент накопичує комплекс ферментів у культуральній рідині. Тому амілолітичну активність визначали безпосередньо у культуральній рідині після звільнення ії від міцелію за методом Асатіані [2].

Амілолітичну активність розраховували за формулою :

  = , де

Дк -різниця оптичної густини контрольного та дослідного зразків;

60 -кількість крохмалю у реакційній суміші, мг;

Р – розведення зразка;

10 -кількість крохмалю, для гідролізу якого потрібна одна одиниця ферментативної активності, мг.

Визначення біомаси проводили ваговим методом і виражали в г/л [7].

Відомо, що одним із способів посилення активності біосинтезу та накопичення ферментів є внесення індуктора у ферментаційне середовище. У якості індуктора , як правило, використовується субстрат.  Виходячи із вищесказаного, для збільшення синтезу амілолітичних ферментів, нами  було проведено індукцію шляхом внесення різних концентрацій крохмалю у ферментаційне середовище. Результати дослідження показали, що у ферментаційному середовищі з 1% крохмалю, максимальна амілолітична активність зареєстрована на 48 годину культивування і  складала 4,7 АЕ/мл,  на 96 годину залишалась приблизно на тому ж рівні  – 4,6 АЕ/мл. Тобто подальшого збільшення активності ферменту не відбувалося (рисунок 1). Максимальна амілолітична активність на 48 годину культивування на ферментаційному середовищі з 2 та 4% крохмалю складала 5,9 та  4,3 АЕ/мл, а на 96 годину – 0,55 та 4,9 АЕ/мл, відповідно. Таким чином, активність ферментів при 2% крохмалю після другої доби знизилася на порядок, а при 4% - незначно зросла та стабілізувалась.

Рисунок 1– Активність амілаз з різною концентрацією крохмалю

 

Як видно з отриманих даних, амілолітична активність залежить від концентрації крохмалю в середовищі та від тривалості культивування.

Аналіз динаміки накопичення амілаз у культуральному середовищі з різною концентрацією крохмалю показує, що найвищого значення  амілолітична  активність  на першу добу досягає на  середовищі з 1% крохмалю. На другу добу культивування значне  збільшення амілолітичної активності зареєстровано  у всіх варіантах досліду, проте максимальне ії значення виявлено у середовищі, з 2% крохмалю, де активність склала 5,9 АЕ/мл, що перевищує інші максимальні значення на цю добу в 1,3 рази. На третю добу культивування штаму  амілолітична активність значно знизилась у  варіантах досліду  з 1 та 2 % субстрату. Звертає на себе увагу те, що у варіанті з 4% активність підвищилась та склала 4,9 АЕ/мл. На цей час припадає і  максимальне значення активності  контрольної проби (5,4 АЕ/мл). На четверту добу відмічається стабілізація активності амілаз при 1% та 4% субстрату та подальше її падіння при  2% і у контрольному варіанті.

При дослідженні динаміки накопичення біомаси штамом 2Р-15 в умовах додавання субстрату в різних концентраціях спостерігали, що на першу добу культивування приріст біомаси перевищував на 38 та 206% рівень контролю при використанні посівного середовища з 2 і 4% крохмалю. Динаміка накопичення біомаси у середовищі з 1% крохмалю незначно відрізнялася від динаміки накопичення у контрольному середовищі.

Через дві доби культивування біомаса досягла максимального значення 259% до контролю при використанні ферментаційного середовища з 4% крохмалю. На середовищі з 2% крохмалю накопичення біомаси перевищило значення контролю на 15%. На третю добу культивування на середовищі з 1% крохмалю відмічалося незначне підвищення біомаси – на 8%; а з 4% субстрату досягало максимального значення, яке на 116% перевищувало контроль. При використанні середовища з 2% крохмалю накопичення біомаси не відбувалося. На 96 годину культивування на середовищі з 1% крохмалю накопичення біомаси також не відбувалося, а на середовищі з 4% крохмалю кількість біомаси зростала до 185% порівняно з контролем.

Рис.2  – Накопичення біомаси штамом 2Р-15 на середовищах з різною концентрацією крохмалю

Як відомо, підвищення рівня накопичення біомаси відбувалося за рахунок збагачення поживного середовища та більш ефективного використання його субстратів [3-6]. Отримані в результаті дослідження штаму 2Р-15 дані показують, що на всіх поживних середовищах максимальне накопичення біомаси відбувалося на першу добу, найбільшого рівня досягало на середовищі з 4% крохмалю і становило – 20,5 г/л.

Таким чином, максимальне накопичення біомаси відбувалося на першу добу розвитку культури та поступово знижувалося до четвертої доби, а синтез вторинних метаболітів (амілаз) мав протилежну тенденцію – поступово зростав до другої та третьої доби культивування, що співпадало з відомими літературними джерелами. В результаті проведених дослідів встановлено, що: максимальне значення активності амілаз припадало на третю добу;  з підвищенням вмісту крохмалю в середовищі підвищувалася доля амілаз та їх активність; не доцільно вносити 4% індуктора в середовище, оскільки при цьому рівень активності ферментів була нижчою, ніж при 2%, процес їх синтезу затримувався; максимальне накопичення біомаси продуценту амілаз відбувалося при вирощувані на середовищі з 4% крохмалю; максимальний вихід амілолітичних ферментів спостерігався на другу добу культивування при додаванні 2 % крохмалю у якості індуктора у ферментаційне середовище.

Поживні середовища з 2% крохмалю можна рекомендувати для використання у біотехнологічних виробництвах, що призведе до скорочення циклу ферментації і забезпечить максимальний економічний ефект.

ЛІТЕРАТУРА:

  1. Sivaramarkrishtan S., Gangadharan D., Kesavan Madhavan Nampoothiri et al. α-Amylases from microbial sources an overview on recent developoments // Food Technol. Biothechnol. — 2006. — V. 44, N 2. — P. 173–184.

2.     Асатиани В.С. Ферментные методы анализа. Москва; Наука, 1989, с.528.

  1. Бабицкая В.Г. Исследование амилолитической активности актиномицетов. Автореф. канд. дисс. – Минск, 1998. -С.58.

4.     Андріюк К.І. Синтез біологічно-активних речовин ґрунтовими актиноміцетами //Мікробіол. ж. – 1988. – ЗО, №5 – 398с.

5.     Фениксова Р.В. и Тихомирова А.С. Среда для накопления амилазы и

протеиназы в глубинной культуре В. subtilis // Микробиология. – 1989. –

29. – №6. – 894с.

  1. Бабенко Ю. С., Килочек Т.П. Оптимизация питательной среды и         направленный биосинтез литических ферментов // Всесоюзная конференция «Управляемое культивирование  микроорганизмов» /Тез.докл. – Пушино,1986. – С.77.