к.б.н. Плескова С.Н. ¹, Гущина Ю.Ю. ²

¹ Кафедра «Биотехнологии, физической и аналитической химии» Нижегородского государственного технического университета, Россия

² НОЦ «Физика твердотельных наноструктур» Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, Россия

Изменения нейтрофильных гранулоцитов в средах с разными значениями рН при механическом воздействии на клетки

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются одним из важнейших клеточных факторов системы неспецифической резистентности. Благодаря высокой мобильности они обнаруживаются в разных тканях, опосредуя реакции пиогенного воспаления. Поскольку рН среды, в которой находятся НГ, может в значительной степени варьировать (от слабощелочных значений в полости рта до слабокислых на раневой поверхности) немаловажным является определение морфо-функциональных характеристик клеток при изменениях рН среды. Кроме того, при проникновении через эндотелий сосудов клетки могут испытывать механические нагрузки. Поэтому целью данной работы являлось исследование НГ методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) в средах с разными значениями рН при механическом воздействии зонда. Метод СЗМ был выбран нами как наиболее адекватный для оценки морфологии нативных НГ с высоким латеральным разрешением и возможностью механического воздействия на клетки.

Клетки выделяли из крови здоровых доноров на двойном градиенте фиколла-верографина и дважды отмывали в физиологическом растворе. Далее их взвешивали в концентрации 0,5 х 10⁶ клеток/мл в исследуемом буфере. Для сканирования поверхности НГ использовали сканирующий зондовый микроскоп SOLVER BIO NT-MDT (Зеленоград). Брали штатные зонды с жесткостью 0,03 N/m, радиус закругления кончика зонда порядка 50 nm.

НГ были исследованы в бедном ионами физиологическом растворе, где в течение всего времени наблюдения рН поддерживалась на постоянном уровне – 7,2; в растворе Хенкса, богатом ионами, где рН варьировала от 7,2 в начале эксперимента до 8,2 – в конце, в фосфатно-солевом буфере, где рН поддерживалась 7,4, а также были предприняты попытки наблюдения за нейтрофилами в чрезвычайно неблагоприятных для них условиях: цитратном буфере (рН 5,0) и карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5).

Результаты наблюдения за НГ в физиологическом растворе представлены на рис. 1.

Рис. 1 СЗМ-сканы живых клеток в физиологическом растворе в течение 30 мин (сканирование производилось через каждые 10 мин): клетка морфологически пассивна.

Проведенное измерение высоты и объема клеток не зафиксировало существенных изменений их параметров на всем протяжении наблюдения (общее время наблюдения составило 90 мин).

Клетки, сканированные в фосфатно-солевом буфере в течение длительного времени поддерживали постоянную морфологию, тогда как после механического воздействия происходило увеличение объема клеток.

В некоторых случаях увеличение объема клеток было настолько выраженным, что мембрана в значительной степени истончалась, становилась «мягкой», «податливой» что препятствовало процессу сканирования.

Сходные результаты получены при сканировании НГ в растворе Хенкса, хотя обогащение ионного состава среды и изменения рН в значительной степени влияют на морфологию клеток и сканирование с незначительной силой в контактном режиме вызывает «набухание» клеток. Результаты исследований представлены на рис. 2.

30 мин 40 мин 60 мин

80 мин 90 мин 100 мин

Рис. 2 СЗМ-сканы нейтрофильных гранулоцитов в растворе Хенкса: при сканировании клеток более чем 30 мин объем их значительно увеличивается.

Таким образом, изменение рН среды оказывает значительное влияние на механические свойства клеток. В бедной ионами среде с постоянным значением рН клетки не чувствительны ни к слабому, ни к сильному механическому воздействию. Обогащение ионного состава среды при постоянном рН (фосфатно-солевой буфер) делает клетку чувствительной к сильному механическому воздействию, что проявляется патологической реакцией набухания клетки. Изменения рН среды при обогащении ионного состава делают клетку максимально чувствительной к любому, даже слабому механическому воздействию.