Біологічні науки

6. Мікробіологія

Л.П. Бабенко, І.Є. Соколова, А.І. Вінніков

Дніпропетровський національний університет

Перспектива використання біосинтетичної активності стрептоміцетів для отримання біологічно активних речовин

Вступ

Стрептоміцети вже досить давно привертають до себе увагу багатьох дослідників у галузях промислової мікробіології, біотехнології та генної інженерії як продуценти біологічно активних речовин. Понад двісті видів антибіотиків, десятки різних ферментів, гормони людини та тварин, стимулятори росту рослин, незамінні амінокислоти, токсини, пігменти – ось далеко не повний список речовин, синтез яких вже відбувається у промислових кількостях з використанням стрептоміцетів [1]. Серед стрептоміцетів інтенсивно ведеться пошук продуцентів вітамінів, ліпідів, нових антибіотиків, літичних ферментів та інших видів біологічно активних сполук, необхідних для людини, тварин та рослин. Оскільки стрептоміцети, зокрема рід Streptomyces, є достатньо вивченою групою мікроорганізмів, пошуки нових продуцентів різноманітних сполук йдуть досить успішно. Використовують не тільки прямий пошук необхідних генів синтезу сполук за допомогою селекції, а й більш складні методи – спрямованого мутагенезу, генної та білкової інженерії, які призводять до появи нових, або модифікації вже відомих вторинних метаболітів [14]. Завдяки дослідженням з генної інженерії, були розроблені і успішно використовуються методи перенесення окремих генів в клітини стрептоміцетів за допомогою трансформації, кон’югації та трансдукції. Особливим досягненням було розроблення методики міжродового та навіть міжродинного перенесення генів, що відповідають за синтез різноманітних сполук [2,4].

Актуальність дослідження вторинних метаболітів стрептоміцетів зумовлена широким розповсюдженням цієї групи мікроорганізмів у грунтах з різним екологічним профілем, що визначає наявність у них надзвичайних біосинтетичних потенцій і здатність синтезувати забагату кількість корисних для людини речовин. Штучний синтез цих сполук займає набагато більше часу, технологічно складніший та потребує більших витрат, ніж отримання тих самих сполук за допомогою стрептоміцетів. Тому подальше вивчення особливостей біосинтезу вторинних метаболітів стрептоміцетами є абсолютно необхідним і повністю виправдовує використані на це кошти.

Антибіотики. Антибіотики – це специфічні продукти життєдіяльності мікроорганізмів, здатні до вибіркової токсичної дії на інші мікроорганізми, віруси, гриби, паразитів та клітини злоякісних пухлин, затримки їхнього росту або цілковитого пригнічення розвитку [2,3,6]. З декількох тисяч відкритих антибіотиків більшість продукується стрептоміцетами. Серед них найбільший внесок дає рід Streptomyces. Один тільки вид Streptomyces grіseus синтезує більше п'ятидесяти антибіотиків [7,8].

Актиноміцини – високотоксичні антибіотики поліпептидної природи. Мають характерне червоне забарвлення. Продукуються стрептоміцетами різних видів. Актиноміцини є інгібіторами ДНК-залежного синтезу РНК. Вони переважно зв'язуються з ділянками ДНК, багатими гуаніном [6]. Антибіотик стрептоміцин має широкий спектр дії, він пригнічує ріст грампозитивних і грамнегативних мікробів, таких, як стафілококи, стрептококи, а головне – діє на збудника туберкульозу. Стрептоміцин найбільш активний в аеробних умовах, не пригнічує ріст анаеробів, грибів, рикетсій, вірусів, механізм його дії зв'язаний з блокуванням синтезу білка. З культуральної рідини S. kanamycetіcus виділений антибіотик канаміцин [7,11]. Препарат пригнічує ріст мікробів, стійких до пеніциліну, стрептоміцину, тетрациклінам і іншим антибіотикам. Токсичність для тварин така ж, як і в стрептоміцину, але нижче ніж у неоміцину, з яким він має багато спільного. Неоміцин – комплекс антибіотиків (коліміцин, міцерін та ін.). Продуцент - S. fradіae та інші стрептоміцети [11,14]. Застосовують сульфат неоміцину В. Неомицин – антибіотик широкого спектра дії, але до нього стійкі клостридії, гриби, деякі штами Pseudomonas aeruginosa. Ансаміцини – група антибіотиків, утворених Streptomyces medіterraneі. Трансформація хімічної структури природних ансаміцинів (рифаміцинів) дозволила одержати напівсинтетичні похідні – рифампіцин (основний представник). Цей антибіотик має широкий спектр дії й ефективний у відношенні багатьох грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів, збудників хвороби легіонерів, бруцельозу, лепри, туберкульозу. Діє він бактерицидно, добре проникає крізь клітинні мембрани і пригнічує синтез РНК, утворюючи комплекс із ДНК-залежною РНК-полімеразою [1,2,6]. Число протипухлинних речовин мікробного походження досить обмежено. Блеоміцин, виділений Умезавой з культур Streptomyces vertіcіllus, являє собою глікопептид, що діє, розриваючи ДНК пухлинних клітин і порушуючи реплікацію ДНК [1,11]. Інша група протипухлинних агентів створена на основі комбінації аміноглікозидної одиниці і молекули антрацикліна. Недоліком обох сполук є їхня потенційна небезпека для серця.

Мікроорганізм Streptomyces grіseus є продуцентом антибіотика кормогризина [3], що одержують при глибинній ферментації мікроба на середовищі, з кукурудзяним борошном, крохмалєм і мінеральними солями. Антибіотик має малу токсичність для теплокровних тварин, пригнічує розвиток значної кількості видів бактерій, грибів і дріжджів. Антибіотик вітаміцин (Streptomyces aureоvertіcіllatus) [14] являє собою висушену культуральну рідину разом з міцелієм. Встановлено, що біологічна активність вітаміцину може компенсувати нестачу в кормах вітаміну А. Препарат прискорює ріст тварин і дозволяє заощаджувати корм. Культурою S. aurіgіneus виробляється антибіотик кормарин, який містить вітаміни групи В, гормоноподібні речовини й інші фактори росту. Використання кормарина в раціонах тварин і птахів підвищує приріст живої маси і поліпшує обмін речовин і засвоюваність компонентів корму [1,11]. Флавоміцин (S. bambergіensіs) застосовують як стимулятор росту свиней. Кормовий антибіотик віргінієміцин (S. vіrgіnіae) є гарним стимулятором росту з тривалою дією, його використовують при вирощуванні тварин. У значних кількостях застосовують румензин (S. cіnnamonensіs) [14], що поліпшує перетравлення корму за рахунок уповільнення швидкості його проходження по травному тракту. Є відомості про широке використання тилозина (S. fradіae), що володіє широким антимікробним спектром.

Протипаразитарні речовини займають значне місце серед метаболітів стрептоміцетів, що застосовуються у ветеринарії і тваринництві. Новим етапом у боротьбі з паразитозами тварин виявилося відкриття авермектинів [1,6], що синтезуються стрептоміцетами, вони мають широкий спектр протипаразитарної активності. На основі цих сполук у ряді країн створені препарати, що містять як діючу речовину івермектин – комплекс гідратованих форм авермектинів. Ці препарати знайшли широке застосування у ветеринарній практиці в багатьох країнах світу, у тому числі і Росії. Мікроорганізмом Streptomyces cyanogriseus sp. p. noncyanogenus продукується сполука – немадектин, з якої шляхом хімічної модифікації виробляють моксідектин, що є діючою речовиною протипаразитарного препарату цидектина. У роботах багатьох дослідників приведені факти про його високу ефективність при паразитозах тварин (нематодозах травного шляху овець). Мільбеміцини [1,3,6], виділені з Streptomyces hygroscopіcus, по хімічній природі являють собою макроциклічні лактони, що володіють широким спектром інсектоакарицидної дії, особливо проти гельмінтів великої рогатої худоби.

Стимулятори росту рослин. Стрептоміцети поряд з іншими групами організмів мають здатність стимулювати ріст рослин, впливати на їхній розвиток. Ця дія викликається особливими речовинами – стимуляторами, що продукуються мікроорганізмами. З них найбільш відомі гібереліни. Вперше гібереліни були виділені японськими вченими з гриба Fusarіum fujіkuroі [13,14], але потім були виявлені й у деяких бактеріях і стрептоміцетах. Найбільшою фізіологічною активністю володіє гіберелін А3 – гіберелова кислота. Через надзвичайну складність будови молекули хімічний синтез зазнає труднощів, перебороти які поки не вдається. Рослини помітно прискорюють ріст при концентрації гібереліну 0,0001 мг. Немає жодного життєво важливого процесу квіткової рослини, на який би обробка гібереліном не мала впливу. Крім гіберелінів, стрептоміцети в процесі життєдіяльності утворюють речовини іншої хімічної природи, що володіють значною стимулюючою дією на рослини. Тому їх часто називають гібереліноподібними речовинами [15]. Такі речовини були виділені з бактерій, стрептоміцетів й інших груп мікроорганізмів.

Рис.1 Стимулююча дія гібереліна на ріст і цвітіння примули. Ліворуч – рослина, оброблена гібереліном; праворуч – контрольна.

Серед стимуляторів давно відомі і добре вивчені ауксини, що викликають розтягування і прискорюють ріст клітин. Їхнє виробництво синтетичним шляхом (на відміну від гіберелінів) вже налагоджено [13]. Особливо помітна стимулююча дія ауксинів на ріст коренів. Найважливішим серед них є гетероауксин – β-індолілуксусна кислота (ІУК). ІУК застосовується в сільському господарстві для прискорення утворення коренів у черешків різних рослин, наприклад цитрусових, для укорінення саджанців [15].

Токсини. Деякі стрептоміцети утворюють токсичні речовини – токсини – сполуки різноманітної хімічної природи, що проявляють отруйну дію у відношенні до різних організмів [2,15].

Рис. 2. Інгібуюча дія токсинів стрептоміцетів на проростки бавовнику. К, К1 – насіння бавовнику, оброблені токсином; ліворуч – контроль.

Токсини можуть бути різного хімічного складу і різної біологічної дії. Особливий інтерес представляють токсини специфічної дії, тобто ті, що вибірково пригнічують ріст певних видів рослин (особливо бур'янів) чи специфічно діють на комах. Стрептоміцети можуть продукувати також речовини, що пригнічують ріст і розвиток корисної мікрофлори рослин. До цих речовин відносяться фітотоксини. Деякі з них різко пригнічують ріст рослин (змочене ними насіння не проростає). Інші токсини діють слабкіше, вони тільки затримують проростання насінь і ріст проростків [4].

Вітаміни та пігменти. Вітаміни являють собою групу порівняно низькомолекулярних органічних сполук різноманітної хімічної природи, що виконують важливі фізіологічні та біохімічні функції у живих організмах. Мікроорганізми мають здатність до синтезу різних вітамінів. Відомі мікроби, що синтезують вітаміни В1, В2, біотин, пантотенову кислоту, піридоксін, нікотинову кислоту та ін. [1,11,15]. Майже всі культури стрептоміцетів здатні продукувати вітаміни групи В. Так, S. olіvaceus утворює антианемічний вітамін В12. Культури S. grіseus 15, S. aureovertіcіllatus 1306 і S. aurіgіneus 2377 у процесі вирощування на різних середовищах синтезують вітаміни групи В (тіамін, рибофлавін, піридоксін, біотин, нікотинову кислоту і вітамін В12) [10].

Багато видів бактерій і стрептоміцетів, пофарбовані в червоно-рожевий, червоно-помаранчевий чи жовтий колір, утворюють попередники вітамінів, так звані провітаміни – каротини і каротиноїди, які відносять також до пігментів. Каротиноїди відіграють роль в окисних процесах у клітині. Біологічно найбільш активний бета-каротин, що є попередником вітаміну А1 і зветься провітаміном А1 [19]. Деякі з пігментів мають антибіотичну дію і фактично є антибіотиками, наприклад міцетин з культури стрептоміцету S. vіolaceus, та ін. Одним з стрептоміцетів виділяється пігмент – вітаміцин, що стимулює ріст тварин [13].

Амінокислоти. У міцелії стрептоміцетів, що є головним відходом мікробіологічного виробництва, накопичується 16-17 амінокислот, мікроелементи, полісахариди і т.д. Загальна сума амінокислот у міцелії коливається від 130,19 до 325,27 мг/кг сухої біомаси. Серед них виявлені незамінні амінокислоти (лізин, гістидин, метіонін, треонін, лейцин, ізолейцин, валін, фенілаланін), частково замінні (аргінін, гліцин, тирозин), замінні (глутамінова, аспарагінова кислоти, аланін, серін, пролін) [7,8]. Амінокислоти усе ширше використовуються у сільському господарстві для підгодівлі тварин, в медичній практиці, харчовій промислвості. В області мікробіології амінокислоти набули широкого застосування для виготовлення середовищ, наприклад, при вирощуванні тканинних культур, для виготовлення вакцин. Амінокислоти використовуються як вихідний матеріал при синтезі пептидів, гормонів, антибіотиків. За допомогою полімеризації амінокислот, насамперед глутамінової кислоти й аланіна, планують одержувати синтетичні волокна [1].

Ферменти. Ферменти – специфічні білки, які присутні в усіх живих клітинах та грають роль біологічних каталізаторів. Завдяки їм відбувається реалізація генетичної інформації та відбуваються всі процеси обміну речовин та енергії. Ферменти мають велике практичне значення, тому що багато галузей промисловості, заснованих на використанні різних ферментативних процесів [5]. Препарати ферментів знаходять усе більше застосування у сільському господарстві, медицині, науково-дослідній роботі. Продуцентами багатьох ферментів, які одержують у виробництві, є стрептоміцети. Наприклад, протеолітичні ферменти, що розщеплюють білки, видобувають з S. grіseus; кератиназа і протеїназа продукуються S. fradіae [9,12]. Целюлази, що руйнують клітковину, використовуються для приготування кормів. Нуклеази – група ферментів, що беруть участь у гідролізі нуклеїнових кислот, – широко використовуються для розшифровки будови ДНК і РНК. Нуклеази були отримані з культур стрептоміцетів, мікобактерій й інших мікроорганізмів [5,12]. Хітинази – це ферменти, що катализують деградацію хітину і діють найбільш часто як ендоферменти, відщеплюючи хітоолігосахариди довжиною в 2 - 6 N-ацетилглюкозамінових залишків. Багато продуцентів хітиназ виявлено серед стрептоміцетів. Перспективним напрямком є використання хітиназ з метою біоконтроля мікопаразитів [9,14].

Ліпіди. Дослідження ряду авторів показують, що ліпіди володіють різною біологічною активністю: антибактеріальною, радіозахисною, імунологічною, протипухлинною і т.д. Існують повідомлення про ад'ювантні властивості окремих ліпідів [1,14]. Ліпідні фракції стрептоміцетів володіють не тільки антимікробними властивостями стосовно ряду тест-мікроорганізмів (грампозитивні і грамнегативні бактерії, дріжджі і дріжджеподібні гриби роду Candіda), але й антиоксидантною активністю, а при внутришньом'язовому введенні підвищують природну резистентність та інтенсивність росту поросяти на 15-20%, що знижує витрати корму на 15-23%.

Фосфоліпіди мікроорганізмів являють собою велику групу сполук, що містять гліцерин, залишок фосфорної кислоти, жирні кислоти і спирти [1]. Фосфоліпіди (у мікроорганізмах їх не менш 10) надзвичайно лабільні, легко перетворюються і беруть участь у метаболізмі клітин. В даний час фосфоліпіди привертають до себе увагу дослідників в аспекті використання їх у якості біоантиоксидантів. В екcтремальних умовах в організмі виникають реакції вільно-радикального окислювання [8]. Блокувати процеси перекисного окислювання можуть тільки речовини, що називаються антиоксидантами. Комплекс ліпідів S. grіseus 15, екстрагований з міцелію петролейним ефіром, має високу біологічну активність, що обумовлена змістом речовин стеринової природи. Стерини у комплексі з полісахаридами і фосфоліпідами мають імуностимулюючу дію при введенні тварині у процесі вакцинації, що дає можливість застосовувати їх для корекції імунної відповіді [14].

Гормони. Стрептоміцети використовуються і для одержання гормонів. Гормони являють собою складні органічні сполуки з високою біологічною активністю, що мають цілеспрямовану дію на органи та тканини організму. Вони регулюють багато життєво важливих процесів – розвиток, дозрівання, ріст, процеси, що керують обміном речовин та ін. [1]. Для медичних цілей гормони одержують із залоз внутрішньої секреції тварин. Але для того, щоб одержати 1 мг гормону, потрібно забити декілька тисяч голів худоби. Хімічний синтез гормонів дуже складний. Мікробіологічний синтез набагато простіший. Він відбувається за рахунок здатності деяких мікроорганізмів стереоспецифічно модифікувати природні та синтетичні сполуки. Цей процес називається трансформацією. Здатність до трансформації стероїдів виявлена у багатьох мікроорганізмів: бактерій, стрептоміцетів, дріжджів, грибів [10,11]. Так, за допомогою стрептоміцетів можуть бути отримані кортизон і гідрокортизон, преднізон і преднізолон – цінні препарати гормональної дії, які широко використовуються в лікувальній практиці.

Алкалоїди. За допомогою стрептоміцетів у даний час можна одержувати деякі алкалоїди – речовини рослинного походження, що є складними гетероциклічними азотистими основами, мають надзвичайно високу фізіологічну активність та сильну дію на тваринний організм. Деякі з них є отрутами. Більшість алкалоїдів паралізують і пригнічують нервову систему, наприклад кокаїн, кураре, морфін, атропін, але деякі з них є незамінними у медичній практиці [8].

Заключення

Стрептоміцети – найбагатше джерело різноманітних фізіологічно активних речовин. Можливості їх воістину невичерпні. На сьогодні відома велика кількість стрептоміцетних метаболітів. З кожним роком наука відкриває нові цінні сполуки, деякі з них раніше не були відомі органічній хімії. За допомогою цих мікроорганізмів одержують швидше, простіше, а головне, дешевше різні біологічно активні речовини [1,14]. Можливості сучасної науки, інтенсивний розвиток біотехнології та генної інженерії зробили можливим використовувати не лише природні можливості стрептоміцетів, але й змінювати генетично запрограмовані процеси синтезу вторинних метаболітів з метою отримання специфічних речовин, та регулювання інтенсивності синтезу біологічно активних сполук стрептоміцетів. Враховуючі всі згадані вище аспекти, можна з абсолютною впевненістю стверджувати, що подальше вивчення особливостей біосинтезу біологічно активних речовин у стрептоміцетів є дуже важливим кроком у покращенні результатів промислового отримання вже відомих вторинних метаболітів та винайденні нових, ще невідомих науці біологічно активних сполук.

Список літератури

1. Быков В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н., Марквичев Н.С.Микробиологическое производство биологически активных препаратов и веществ.–М.: Высшая школа., 1987, 214 с.

2. Валагурова У.В., Козырицкая В.Е., Иутинская Г.А. Стрептомицеты рода Streptomyces.–Киев, Наукова думка.-2003.-647 с.

3. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учеб. Для студентов биолог. спец. ун-тов.-4-е узд., перераб. И доп.–М.: Высш. Шк.., 1986. -448 с.: ил.

4. Зенова Г. М. Почвенные стрептомицеты. – М.: Изд-во МГУ, 1992, 378 с.

5. Литические ферменты микроорганизмов. Под ред. И.Я. Захарова, И.Н. Павлова.–Киев: Наукова думка,1985.-216 с.

6. Мацелюх А.Б. Стрептоміцети – продуценти полікетидних антибіотиків //Мікробіол. журн. - 2003. - Т.65, №1-2. - С. 168-181.

7. Метаболизм микроорганизмов: Учебн. Пособие. Под ред. Н.С. Егорова.– М.: Изд-во МГУ. 1996.-256 с., ил.

8. Микробные метаболиты (физиологически активне вещества микробного происхождения в природе и народном хозяйстве).–М.: Изд-во МГУ, 1979 г., 222 с., с ил.

9. О.В. Іванко, Л.Д. Варбанець. Кератинолітична активність Streptomyces SP. 1382// Мікробіологічний журнал, 2004. Т66. №1

10. Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии: Пер. с англ.–М.: Мир, 1984.-176 с., ил.

11. Соколова И.Е, Килочек Т.П., Винников А.И. Биосинтетическая активность Streptomyces recifensis var. lyticus. // Мікробіологічний журнал., 2004. Т66, №6, стор 17-22

12. Соколова И.Е. Субстратная специфичность внеклеточных литических эндопептидаз Streptomyces recifensis var. lyticus 2435. // Вісник дніпропетровського університету. Біологія. Екологія., вип.. 9, том 2. 2001 p.,стор. 83-86.

13. Технология биологически активных веществ. Ч.2. Промышленная технология производства ГЛС и фитопрепаратов: Учеб. пособие для студентов вузов.-Х.: Изд-во НФАУ: Золотые страницы, 2002.-96 с.

14. Федренко В.О., Осташ Б.О., Гончар М.В., Ребець Ю.В. Великий практикум з генетики, генетичної інженерії та аналітичної біотехнології мікроорганізмів. Навчальний посібник для студентів біологічних факультетів університетів.–Львів: Ізд. ЛНУ, 2005 р., 356 с.

15. Цавкелова Е.А., Климова С.Ю., Чердынцева Т.А. Микроорганизмы –продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение.// Прикладная биохимия и микробиология, 2006, том 42, № 2, стр.133-143