Н.А. Мойсеенко, Е.Н. Репина*, М.С. Кетова

Сыктывкарский государственный университет, Коми государственный педагогический институт*

Количество, спектр и адгезия лейкоцитов крови крыс при иммобилизационном стрессе на фоне действия экдистероидсодержащей субстации Серпистен

От функционального состояния белых клеток крови (лейкоцитов), зависит целый комплекс важных функций организма (Н.А. Агаджанян, М.З. Федорова, 2001), в частности эффективность работы системы кровообращения, играющей важную роль в адаптационных перестройках функционального состояния организма. При этом особое значение приобретает функциональное состояние белых клеток крови (нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов).

Цель работы - исследование адгезионной способности, количественного и качественного состава лейкоцитов крыс при иммобилизационном стрессе на фоне однократной, за 24 ч и до инъекции экдистероидсодержащей субстанции (ЭС) Серпистен в дозе 20 мг/кг. Состав субстанции Серпистен: 20-гидроксиэкдизон (20Е) – 80% , инокостерон – 11%, б-экдизон – 5%, другие минорные фракции. Выделена из надземной части растений Serratula coronata L. в лаб. биохимии и биотехнологии растений Института Биологии Коми НЦ УрО РАН (зав. – д.б.н., проф. В.В. Володин) (Пат. РФ № 2153346, № 2276991, товарный знак № 282636 от 22.05.2005 г.; приоритет 04.08.2005 г.). Исследования выполнены на 3-х мес беспородных крысах обоего пола массой 226,7±4,3г у самцов и - 206,8±3,4г у самок (n=90). Иммобилизационный стресс вызывали путем фиксации крыс в положении на спине в течение 30 мин. Общее количество лейкоцитов и подсчитывали общепринятым методом в камере Горяева (А.Я. Любина и соавт., 1971; В.В. Меньшиков и соавт. 1987). Количественное соотношение различных видов лейкоцитов определяли дифференцированным подсчетом клеток на мазках крови (Й. Тодоров, 1963; Е.А. Кост, 1975). За основу исследования адгезионной способности лейкоцитов взята методика, описанная Л.Г. Зайцевым (2000).

Показано (табл.1), что при развитии иммобилизационного стресса у животных независимо от пола наблюдается повышение (p<0,05) общего количества лейкоцитов по сравнению с исходным показателем у интактных, что может быть свидетельством вовлечения клеток белой крови в стрессорные реакции организма: в частности, у самцов уровень лейкоцитов повышается на 28,6% (р<0,1). В лейкоцитарной формуле отмечаются сдвиги в сторону

Таблица 1

Лейкоцитарная формула нелинейных крыс при иммобилизационном стрессе (30мин) в условиях действия

ЭС Серпистен (М±m_x)

Показатель	группа		Интактная (13/11)	Стресс (14/9)	Серпистен (11/11)	Серпистен+ cтресс (10/11)
	Кол-во жив-х ♂/♀
Лейкоциты,тыс/мкл		♂	3,5±0,3	4,5±0,4*	3,4±0,2^ст	4,3±0,4
		♀	4,7±0,7	4,9±0,4	4,2±0,3	4,4±0,4
Палочкоядерные,%		♂	4,0±0,2	4,1±0,3	4,1±0,3	3,9±0,4
		♀	3,7±0,2	5,1±0,3***	3,7±0,2^ст	4,5±0,5
Сегментоядерные,%		♂	19,5±0,5	16,8±0,3***	18,9±0,3^ст	17,6±0,5**^с
		♀	18,7±0,5	16,7±0,4**	18,9±0,5^ст	17,8±0,4^ст
Базофилы,%		♂	0,8±0,2	1,1±0,2	0,7±0,1	0,8±0,2
		♀	0,9±0,2	1,3±0,2	1,1±0,2	1,3±0,2
Эозинофилы,%		♂	1,5±0,2	2,6±0,3**	1,7±0,2^ст	1,6±0,2^ст
		♀	2,1±0,3	3,4±0,3**	1,9±0,2^ст	1,5±0,3^ст
Моноциты,%		♂	6,5±0,3	5,3±0,2**	5,5±0,3*	4,8±0,4***
		♀	6,7±0,3	6,1±0,3	6,7±0,2	7,4±0,3^ст
Лимфоциты,%		♂	67,7±0,8	70,1±0,5*	69,1±0,6	71,3±0,6**^с
		♀	67,9±0,6	67,4±0,7	67,7±0,7	67,5±0,8

Примечание: в скобках показано число животных самцов и самок соответственно; разница по сравнению с интактной группой достоверна при р<0,05*, р<0,01**, р<0,001***; разница с группой Стресс достоверна при р<0,05^ст, р<0,01^ст, р<0,001^ст; разница с группой Серпистен достоверна при р<0,05^с.

повышения на 3,5% доли лимфоцитов (р<0,05), доли базофилов на 37,5% (вероятность более 70%) и доли эозинофилов на 72% (р<0,01), что, по-видимому, обусловливает повышение общего количества лейкоцитов. Повышение доли эозинофилов может говорить о неспецифической реакции организма, проявляющейся в ответ на действие раздражителя – стрессора (Ю.И. Шилов, С.Г. Орлова, 2000). Наряду с этим у самцов зафиксировано снижение доли сегментоядерных нейтрофилов на 14% (р<0,001) и моноцитов на 18,5% (р<0,01). Остальные показатели клеточного состава лейкоцитов крови самцов достоверно не изменяются. У самок наблюдается существенное повышение доли палочкоядерных нейтрофилов на 37,8% (р<0,001) в отличие от самцов, у которых она не изменяется, более значительное (на 44,4%) повышение доли базофилов (тенденция более 80%), аналогичное самцам увеличение доли эозинофилов на 61,9% (p<0,01), но одновременное, как и у самцов, снижение, хотя и в меньшей степени, сегментоядерных нейтрофилов на 10,7% (p<0,01), моноцитов на 9% (тенденция более 80%).

Важной клеточной реакцией, в значительной степени, зависящей от состояния мембраны и примембранных слоев (в том числе гликокаликса) является адгезионная способность (А.Н. Маянский, 2003). Повышение адгезии лейкоцитов к сосудистому эндотелию может привести к снижению тканевого кровотока вследствие обструкции микроциркулярного русла В.И. Козловский, А.В. Акуленок, 2006. Нами показано (табл.2), что доля адгезирующих клеток

Таблица 2

Изменение адгезионной способности лейкоцитов крови нелинейных крыс при иммобилизационном стрессе (30мин) в условиях действия

ЭС Серпистен (М±m_x)

группы		Ан,%	Ас,%	Ав,%	Аа,%
Интактная	♂ n=13	49,8±1,3	26,7±1,7	23,5±2,5	50,2±1,3
	♀ n=11	52,0±1,8	31,6±1,5	16,3±2,4	48,0±1,8
Стресс	♂ n=14	42,2±2,1**	30,3±1,6	27,5±3,1	57,8±2,1**
	♀ n=9	44,6±3,5	30,7±0,9	24,7±3,4	55,4±3,5
Серпистен	♂ n=11	49,2±1,8^ст	28,2±1,8	22,6±2,6	50,8±1,8^ст
	♀ n=11	46,7±1,8*	33,6±1,0^ст	20,2±1,6	53,3±1,8*
Серпистен+ стресс	♂ n=10	43,4±1,6**^с	30,0±1,2	26,6±2,4	56,6±1,6**^,с
	♀ n=11	49,9±3,3	34,3±1,2^ст	15,8±3,6	50,1±3,3

Примечание: n – количество животных; А_а – общее количество адгезировавших лейкоцитов; А_с - клетки со средней силой сцепления; А_в - клетки с высокой силой сцепления; А_н - неадгезировавшие клетки; разница по сравнению с интактной группой достоверна при р<0,05*, р<0,01**; разница с группой Серпистен достоверна при р<0,01^с; разница с группой Стресс достоверна при р<0,05^ст.

белой крови интактных нелинейных крыс составляет в среднем 50,2% у самцов и 48% у самок, что соответствует данным М.З.Федоровой и соавт. (2000).

Характер распределения адгезионной способности белых клеток крови (лейкоцитов) по классам в зависимости от силы сцепления: низкую адгезионную активность имели 49,8% клеток самцов и 52% - самок; средние силы сцепления имели 26,7% и 31,6% клеток, высокие – 23,5% и 16,3%. Дифференциальный подсчет показал, что у интактных крыс адгезионная активность обеспечивается преимущественно нейтрофилами (рис. 1).

Рис.1. Адгезионная способность (%) лимфоцитов и нейтрофилов крови нелинейных крыс самцов при иммобилизационном стрессе (30мин) в условиях действия ЭС Серпистен.

Примечание: * - достоверность различий между лимфоцитами и нейтрофилами, р<0,05.

В ответ на иммобилизационный стресс выявлено повышение на 15% в среднем (р<0,1-0,05) адгезионной способности лейкоцитов крыс независимо от пола, что может говорить о вовлечении системы крови в стрессорные реакции организма. Соотношение лейкоцитов показало, что повышение адгезии обусловлено прежде всего активацией популяции лимфоцитов. Количество клеток, имеющих средние силы сцепления, достоверно не изменяется. У самок увеличивается на 34% (р<0,1) число клеток с высокой силой сцепления.

В ответ на введение крысам ЭС Серпистен количественный состав клеток белой крови, как самцов, так и самок практически не меняется, соответствует таковому у интактных (табл. 1). Исключение составляет снижение доли моноцитов в крови самцов (15,4%, р<0,05) и тенденция (более 70%) к снижению доли сегментоядерных нейтрофилов (P<0,3). Кроме того, отмечена тенденция к повышению доли лимфоцитов (более 80%) и базофилов (более 70%). При этом доля адгезировавших лейкоцитов крови самцов соответствует таковой у интактных животных. У самок отмечается незначительное увеличение клеточной адгезии (на 9%), что гораздо меньше выражено, чем в ответ на иммобилизационный стресс. Адгезионная способность лейкоцитов обеспечивается средними силами сцепления клеток (в основном за счет нейтрофилов, как это наблюдается в интактной группе).

Проводя иммобилизационный стресс на фоне предварительного (за 24 ч) введения Серпистена мы рассчитывали на снижение эффектов только стресса за счет известного (Н.А. Мойсеенко и соавт., 2005; Фитоэкдистероиды, 2003; L. Dinan, 2001) адаптогенного действия Серпистена. Действительно мы получили сдвиги в сторону нормализации, но не по всем снимаемым параметрам: по общему количеству лейкоцитов, по доле в нем сегментоядерных и (у самок) палочкоядерных нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов у самок. Полагаем, что, нормализующее действие ЭС Серпистен обусловлено усилением неспецифической сопротивляемости организма к действию неблагоприятных факторов (иммобилизационный стресс), что делает его перспективным для использования в качестве иммуностимулятора. Доля же базофилов, испытывая в ответ на стресс только тенденцию к увеличению, при стрессе на фоне предварительного введения Серпистена увеличивается еще больше и уже достоверно. То же самое наблюдается в отношении доли моноцитов у самцов: доля их снижается в ответ только на иммобилизацию и еще больше снижается на иммобилизацию на фоне Серпистена. То есть эффект иммобилизационного стресса на фоне Серпистена не уменьшается, а напротив, усиливается. Не исключено, что это тоже проявление адаптации организма к стрессовой ситуации. Например, базофилы синтезируют гепарин (А. Хэм, Д. Кормак, 1983). Учитывая, что при стрессе наблюдают (П.Д. Горизонтов и соавт., 1983) выброс эритроцитов из депо и даже полицитемию, это необходимо для снижения вязкости крови.

Исследования адгезионной способности лейкоцитов крови крыс из группы, которым до иммобилизации вводили Серпистен, показали заметно менее выраженный эффект повышения адгезивных способностей лейкоцитов, чем в группе крыс, которым делали только иммобилизацию, особенно у самок, что подтверждает адаптогенное действие ЭС Серпистен. Вместе с тем у самок наблюдается достоверное увеличение числа клеток, имеющих средние силы сцепления на (12%, р<0,05) по сравнению с только стрессорными животными.

Адгезия клеток крови крыс при стрессе на фоне действия ЭС Серпистен обеспечивается преимущественно лимфоцитами независимо от пола животного, т.е. при сочетанном действии двух факторов превалирует эффект стресса, хотя и менее выраженный, чем только на стресс.

Полагаем, что ЭС Серпистен связывается с адгезивными рецепторами клеточных мембран, снижая, тем самым, адгезионную способность клеток и улучшая микроциркуляцию крови в сосудах в условиях стресса. Предположение основано на результатах работы H. Matsuda et al. (1970) об антиатеросклеротическом действии фитоэкдистероидов. Возможной причиной изменения адгезионных свойств лейкоцитов являются и гуморальные сдвиги в плазме крови, связанные с интоксикацией и тяжелыми метаболическими расстройствами в тканях, опосредующие через рецепторны изменения функционального состояния мембранных структур и цитоскелета, структур, участвующих в прикреплении клетки к субстрату. Наблюдаемые нами различия адгезионной способности лейкоцитов крови самок и самцов, возможно, объясняются разными гормональным фоном организма. Изменения функционирования мембран являются начальным звеном многоступенчатой цепи многих последовательных нарушений биохимических и физиологических функций организма (М.Н. Маслова, 2005).

Агаджанян Н.А., Федорова М.З. Реактивность лейкоцитов в различных условиях окружающей среды // Экология человека. 2001. № 4. С. 66-68.

Зайцев Л.Г. Комплексный анализ гемореологических профилей у мужчин и женщин при разных функциональных состояниях организма: Автореф. дисс... д-ра. биол. наук. Москва. 2000. 32 с.

Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. – М.: Медицина, 1983. - 240 с.

Козловский В.И., Акуленок А.В. Прогнозирование больных артериальной гиертензией // Рецепт. 2006. № 1. С. 131-137.

Кост Е.А. Справочник по клиническим и лабораторным методам исследования. M.: Медицина, 1975. 287 с.

Любина А.Я., Спектор И.С., Катасонова Т.В. Программированное пособие по методам клинических лабораторных исследований. М., 1971. 304 с.

Маслова М.Н. Молекулярные механизмы стресса // Росс. физиол. журнал им. И.М. Сеченова. 2005. Т. 91. № 11. С.1320-1328.

Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. Нижний Новгород. 2003. 150с.

Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с.

Мойсеенко Н.А., Иванкова Ж.Е., Репина Е.Н., Володин В.В. Роль 20-гидроксиэкдизона растений Serratula coronata L. в развитии вызванной гемолитической анемии крыс Wistar // Матер. IX междунар. Съезда Фитофарм 2005. Конференции молодых ученых Европейского Фитохимического общества «Растения и здоровье», Санкт-Петербург, 2005. С. 179-184.

Пат. 2153346, Россия, МКИ³ А 61 К 35/78. Способ получения экдистероидов / В.В. Володин, С.О. Володина; Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; N 99106351/14;Заявл.29.03.99;Опубл. 27.07.2000. Б.И. N 21.

Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София: Физкультура и медицина, 1963. 608 с.

Федорова М.З., Левин В.Н., Горичева В.Д., Семенова О.Н. Сезонные колебания неспецифической активности и сопротивляемости осмотическим и механическим воздействиям лейкоцитов периферической крови // Ярославский педагогический вестник. 2000. № 3. С. 48-51.

Фитоэкдистероиды / Под ред. В.В. Володина. СПб.: Наука. 2003. 293 с.

Хэм А., Кормак Д. Гистология Ч. 2. М.: Мир, 1983. 253 с.

Шилов Ю.И., Орлова С.Г. Адренергические механизмы регуляции фагоцитарной активности клеток белой крови крыс при остром стрессе // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2000. № 5. С. 563-566.

Dinan L. Phytoecdysteroids: biological aspects // Phytochemistry. 2001. V. 57. № 3. Р. 325-339.

Matsuda H., Kawaba T., Yamamoto Y. Pharmacological studies of insect metamorphosis steroids from Achyranthis radix // Folia Pharmac. 1970. V. 66. P. 551-563.