Медицина/ 6. Експериментальна та клінічна фармакологія

Сидорчук С.Г., Огоновський Р.З., Пастернак Ю.Б.

Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького

Трансаміназна активність та оцінка динаміки її зміни в біоптатах тканин рани при застосування 3 % мазі композиційної суміші γ-кротонолактону та Zn-карнозину

Рановий процес, який розвивається у відповідь на пошкодження тканини, характеризується стадійним перебігом, стереотип якого притаманний як хірургічним, так і випадковим ранам, незалежно від того, асептичні вони, чи інфіковані, загоюються первинним чи вторинним натягом. За місцевими та загальним реакціями організму його можна розглядати як окремий випадок запалення, для якого типовими є послідовна зміна двох фаз: деструктивної та репаративної [1, 5].

У даний час проводяться роботи по створенню нових лікарських препаратів, які б за своїм механізмом дії відповідали патогенетичним процесам, суттєво підвищували ефективність лікування ран та забезпечували профілактику ранових ускладнень [2, 4].

Враховуючи сказане, цікавим для експериментального та клінічного дослідження буде комплексний препарат, який представляє собою композиційну суміш ефективного антибактеріального препарату та речовини, яка володіла б вираженими антиоксидантними і антигіпоксидними властивостями. Групою авторів було запропоновано нову композиційну суміш похідних γ-кротонолактону, хелатних комплексів Zn-карнозину і суміш карбонових кислот (надалі – КС), яка є принципово новою біологічно-активною хімічною композицією, в основі якої лежать речовини природного походження, що мають низьку токсичність, високий рівень біотрансформації, не акумулюються в організмі, при цьому володіють широким спектром фармакологічної активності. У своїх дослідженнях було застосовували 3 % мазь вказаної композиційної суміші, а також додатково добавляли тримекаїн, настойку живокосту лікарського, софори японської, прополісу, вітамін Е, димексид, і емульгатор №1 у запатентованих відповідних співвідношеннх [3].

Метою досліджень було вивчення особливостей катаболічного періоду загоєння експериментальних дерматомних ран та можливість їх корекції шляхом місцевого лікування маззю композиційної суміші похідних γ-кротонолактону та Zn-карнозину.

Матеріали та методи. Усі експериментальні тварини (білих нелінійних статевозрілих щурах-самцях з масою тіла 180-220 г), були розподілені на наступні піддослідні групи: контрольна група – тваринам лікування не проводили, модельована рани на спині гоїлися самостійно вторинним натягом; дослідна група 1 – у цих тварин, починаючи з наступного дня після моделювання дерматомної рани, одноразово на добу впродовж усіх термінів спостереження наносили на ранову поверхню однакову кількість (200 мг) розробленої мазі похідних γ-кротонолактону та Zn-карнозину; дослідна група 2 – після моделювання дерматомної рани, тваринам одноразово на добу впродовж усього експерименту наносили однакову кількість (200мг) скринінг-препарату – мазь "Метилурацил з мірамістином". Окрему групу склали інтактні тварини, у яких визначали фізіологічний рівень досліджуваних показників.

Стандартну дерматомну рану моделювали при допомозі попередньо виготовленого округлого трафарету загальною площею 400 мм² (діаметром 20мм) за методикою, описаною Л.М.Шереметою (1998). Так як при виконанні роботи досліджувався характер перебігу експериментального інфікованого ранового процесу м’яких тканин, термінами спостереження було обрано його ключові етапи загоєння – 3, 5, 7, 10, 14, 21 доби, коли послідовно змінюється фаза гострих запальних явищ з вираженою гідратацією, фазами деградації та некролізу, початком розвитку грануляцій, повним виповненням поверхні рани грануляційною тканиною, початком краєвої епітелізації та завершенням рубцювання відповідно.

Для біохімічних дослідження ділянку рани та навколишньої непошкодженої шкіри висікали, впродовж 5-6 хв їх зберігали на льоді та приготовлю вали гомогенат дермальних тканин.

Визначення активності аланінамінотрансферази та аспартатамінотрансферази здійснювали спектрофотометричним методом за F.Wroblewski, G.C.La Due та за А.Karmen відповідно при допомозі наборів фірми “SIMCO Ltd”.

Принцип методу: в результаті переамінування, що проходить під дією АлАТ або АсАТ, де утворюється глютамінова та щавлевооцтова кислоти (АлАТ) або глютамінова та піровиноградна кислоти (АсАТ). При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину у лужному середовищі утворюється забарвлений гідразон піровиноградної кислоти відповідно активності ферменту. Максимум поглинання забарвленого комплексу при 500-560 нанометрів. Лінійність наборів 0,05-5,0 мкмоль пірувату/год мл. Відтворюваність результатів – не < 95 %, коефіцієнт варіації – не >5 %. Одиницями виміру служили мкмоль/г, показник де Рітіса визначали шляхом відношення отриманих даних АсАТ до АлАТ.

Математико-статистичну обробку отриманих результатів досліджень проводили за допомогою персонального комп'ютера із інстальованим відповідним програмним пакетом "StatSoft Statistica 8". Порівняння середніх величин у різних групах здійснювали за допомогою класичного параметричного t-критерію. При співставленні результатів використовували оцінку розходжень за методом, адекватним для малих вибірок, використовуючи таблицю критерія Стьюдента. Розходження приймали достовірним при р<0,05.

Результати досліджень та обговорення. Будучи внутрішньоклітинними ферментами, аспартатамінотрансфераза (АсАТ) та аланінамінотрасфераза (АлАТ) характеризуються своєю стабільністю як за вмістом, так і за активністю у неушкоджених тканинах, та виконують функцію переносу аміногруп з амінокислот на кетокислоти, відновлюючи тим самим структуру уражених ділянок мембран клітин. Ушкодження цих мембран підвищує ферментативну активность, а швидка їх мінливість при дії пошкоджуючих факторів на організм використовується як маркер інтенсивності цитолітичних процесів в динаміці загоєння ран та ефективності корекції різноманітними фармакологічними препаратами.

Схема досліду та використані методики моделювання не відрізнялися від описаних у попередньому розділі. Отримані дані щодо вмісту АсАТ в біоптатах ран тварин усіх експериментальних груп представлено у таблиці 1 та рисунку 1.

Таблиця 1

Вміст АсАт у біоптатах дерматомних ран, (M±m, n=10)

Терміни досліджень, доби	Експериментальні групи; отримані показники, мкмоль/г
	Контроль	Мазь КС	Скринінг-препарат
Інтактні тварини	0,85±0,02	0,85±0,02	0,85±0,02
3	1,70±0,05*^1	1,31±0,05*^1*^2	1,45±0,05*^1*^2
5	1,61±0,03*^1	1,02±0,04*^1*^2	1,29±0,04*^1*^2
7	1,45±0,05*^1	0,97±0,02*^1*^2	1,15±0,03*^1*^2
10	1,20±0,05*^1	0,93±0,05*^2	1,06±0,03*^1*^2
14	1,02±0,04*^1	0,90±0,02*^2	0,97±0,05*^1
21	0,94±0,03*^1	0,85±0,03*^2	0,89±0,02
Примітки: 1. *^1 – статистично достовірний результат відносно інтактних тварин 2. *^2 – статистично достовірний результат відносно контролю

Трансаміназна активність внаслідок інтенсивних запальних процесів та домінування катаболічних явищ у тканинах рани у перші дні після їх альтерації помітно збільшується у всіх експериментальних групах тварин. Найбільше збільшення вмісту АсАТ виявлено у тварин контрольної групи, де рановий процес перебігав без стороннього зовнішнього впливу. Так, на 3-ю добу їх кількість збільшувалася до 200 % щодо показника інтактних тварин. У всі наступні терміни спостереження відмічено поступове рівномірне зниження вмісту АсАТ до 189,41 % інтактного рівня на 5-у добу, 170,58 % (р₁<0,05) на 7-у, 141,17 % на 10-у, 120 % (р₁<0,05) на 14-у та 110,59 %

(р₁<0,05) на 21-у добу.

Рис. 1. Відсоткове співвідношення показників АсАТ в біоптатах рани тварин різних експериментальних груп до показника інтактних (100 %)

За характером зміни вмісту АсАТ показники тварин дослідної групи 1, де проводилося місцеве лікування маззю КС, помітно відрізнялися від контролю. Їх початкове зростання на 3-ю добу було суттєво меншим, що свідчило про менш виражені процеси деструкції, та складало лише 154,11 % (р₁<0,05, р₂<0,05). Проте вже на наступному терміні (5-а доба) відмічено помітне зменшення їх вмісту до 120 % (р₁<0,05, р₂<0,05). Надалі визначалося значно менше падіння активності АсАТ, яке на 7-у добу становило 114,12 % та ще достовірно різнилося до як показника інтактних тварин, так і контролю (р₁<0,05, р₂<0,05). Але на 10-у добу отримані дані склали 109,41 % та недостовірно різнилися до показників здорових тварин (р₁>0,05) з достовірною різницею до контролю (р₂<0,05). Вказана тенденція зберігалася і надалі: на 14-у добу отримані показники дорівнювали 105,88 % з р₁>0,05 та р₂<0,05, а на завершення (21-а доба) не відрізнялися від інтактного рівня.

Проміжне місце між описаними вище займали отримані дані у тварин дослідної групи 2, де лікування проводили препаратом порівняння – маззю "Метилурацил з мірамістином". На початку (3-я доба) первинне зростання відбулося до 170,58 % (р₁<0,05, р₂<0,05). Подальші терміни спостереження характеризувалися рівномірним зменшенням досліджуваного показника з 151,76 % (р₁<0,05, р₂<0,05) на 5-у добу, до 135,23 % (р₁<0,05, р₂<0,05) на 7-у, 124,7 % (р₁<0,05, р₂<0,05) на 10-у, 114,12 % (р₁<0,05, р₂>0,05) на 14-у добу. І лише на 21-у добу показники вмісту АсАТ недостовірно різнилися до інтактного рівня та склали його 104,7 % з р₁>0,05 та р₂>0,05.

Дослідження за вмістом ще одного ферменту із групи трансаміназ – АЛАТ вказали на значно менш виражені його зміни в тканинах дерматомної рани. Отримані дані представлено у таблиці 2 та рисунку 2.

Таблиця 2

Вміст АлАт у біоптатах дерматомних ран, (M±m, n=10)

Терміни досліджень, доби	Експериментальні групи; отримані показники, мкмоль/г
	Контроль	Мазь КС	Скринінг-препарат
Інтактні тварини	0,40±0,04	0,40±0,04	0,40±0,04
3	0,54±0,06*^1	0,50±0,03*^1*^2	0,52±0,05*^1*^2
5	0,53±0,03*^1	0,43±0,05*^1*^2	0,51±0,03*^1*^2
7	0,49±0,02*^1	0,42±0,05*^1*^2	0,47±0,04*^1*^2
10	0,47±0,02*^1	0,41±0,04*^2	0,46±0,03*^1*^2
14	0,44±0,03*^1	0,41±0,05*^2	0,43±0,04*^1
21	0,42±0,03*^1	0,40±0,05*^2	0,41±0,04
Примітки: 1. *^1 – статистично достовірний результат відносно інтактних тварин 2. *^2 – статистично достовірний результат відносно контролю

Як і при попередньому дослідженні, найбільше зростання вмісту АлАТ було виявлено на 3-ю добу у нелікованій групі, яка слугувала контрольною – відповідно до 135 % (р₁<0,05) та рівня інтактних тварин. У всі наступні терміни спостерігалося поступове зменшення досліджуваного показнику, проте із достовірною різницею у всі терміни до даних інтактних тварин. Так, на 5-у добу відмічено зменшення вмісту АлАт до 132,5 % показника здорових тварин, на 7-у – далі до 122,5 % (р₁<0,05), на 10-у – 117,5 % (р₁<0,05), на 14-у – 110 % (р₁<0,05), і на закінчення у 21-у добу – до 105 % (р₁<0,05) інтактного рівня.

Рис. 2. Відсоткове співвідношення показників АлАТ в біоптатах рани тварин різних експериментальних груп до показника інтактних (100 %)

Найменше первинне зростання та найшвидшу нормалізацію активності АлАТ було виявлено у дослідній групі 1 з місцевим лікуванням маззю КС. На 3-ю добу її вміст зростав до 125 % , що достовірно різнилося інтактному рівню (р₁<0,05), так і даним у цей час у контролі (р₁<0,05). Вказана достовірність, незважаючи на падіння вмісту досліджуваного ферменту, у різниці до інтактних тварин зберігалася і впродовж двох наступних термінів спостереження: на 5-у добу дотримані дані рівнялися його 107,5 % (р₁<0,05, р₂<0,05), на 7-у – 105 % (р₁<0,05, р₂<0,05). У трьох наступних термінах статистична достовірність була лише у порівнянні з контрольною групою: на 10-у та 14-у доби отримані дані були практично однаковими та складали
102,5 % (р₁>0,05, р₂<0,05) до інтактного рівня, а на завершення повністю співпадала з ним.

Як і в попередньому дослідження, отримані дані тварин дослідної групи 2, де лікування рани здійснювалося маззю "Метилурацил з мірамістином", впродовж усього експерименту займали проміжне між описаними вище групами положення. Достовірну різницю до даних інтактних тварин та контрольної групи виявлено у перші терміни дослідження до 10-ї доби. У ці терміни отримано наступні результати: на 3-ю добу первинне зростання становило 130 % (р₁<0,05, р₂<0,05), на 5-у спостерігалося зменшення до 127,5 % (р₁<0,05, р₂<0,05), а на 7-у та 10-у – дальше зменшення до 117,5 % (р₁<0,05, р₂<0,05) та 115 % (р₁<0,05, р₂<0,05). На 14-у добу показник на рівні 107,5 % був ще достовірно більшим до показника інтактних тварин (р₁<0,05) та недостовірно різнився у порівнянні з контрольною групою (р₂>0,05). У період завершення експерименту (21-а доба) вміст АлАТ знижувався до рівня 102,5 % з р₁>0,05 та р₂>0,05.

Висновки. Отримані дані вказують на підвищену цитолітичну активність у першій катаболічній фазі ранового процесу. Місцеві аплікації мазі КС, яка володіє завдяки вмісту у ній Zn-карнозину мембранопротекторними властивостями, зменшують інтенсивність деструктивних процесів, які відбуваються на тлі вторинної альтерації продуктами вільно радикальних реакцій, у першу чергу ліпідних ділянок клітинних мембран.

Література.

1. Галимзянов Ф.В. Лечение инфицированных ран и раневой инфекции. Учебное пособие. / Ф.В. Галимзянов // Екатеринбург: УГМА, 2012. – 88 с.

2. Коньков Д.Г. Фармакотерапевтична ефективність мазей, що містять відборон, при експериментальних ранах: автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд.мед.наук: спец.14.03.05 "Фармакологія"/ Д.Г.Коньков. – Одеса, 2009. – 20 с.

3. Патент на корисну модель № 76971. Антимікробний, протизапальний, регенеруючий, знеболюючий засіб для терапії 2-3 фази ранового процесу, опіків, гнійно-запальних захворювань шкіри / С.Г. Сидорчук, І.М. Бобиляк, Р.М. Федін, І.В. Стубіцький, Р.З. Огоновський, Ю.Б. Пастернак; реєстрація - 25.01.2013.

4. Kieser D. C. Leading wound care technology : The ARANZ medical silhouette / D. C. Kieser, C. Hammond // Adv. Skin Wound Care. – 2011. – № 2. – P. 68–70.

5. White R. Wound colonization and infection: the role of topical antimicrobials/ R. White, R. Cooper, A. Kingsley // Brіtish Journal Nursery. – 2011. – Vol. 10, № 9. – P. 563-578.