Мор’єва О.В.

Національний університет харчових технологій, м. Київ, Україна

Фенілаланін: сфери застосування, способи отримання, мікробні продуценти

Виробництво амінокислот відіграє важливу роль в світовій індустрії: щороку їх виробництво складає близько 2 млн т, що зумовлено важливими функціями їх в організмі. Однак Україна імпортує близько 100 % кормових амінокислот для сільського господарства, однією з яких є фенілаланін, що свідчить про недостатній розвиток промислового виробництва амінокислот в Україні [1].

Однією з незамінних амінокислот є фенілаланін, який можна отримувати гідролізом природних білків, мікробіологічним методом, ферментативним синтезом, хімічним синтезом та біотехнологічним способом. Здатність до синтезу фенілаланіну виявлено у представників родів: Bacillus та Escherichia. Однак для отримання фенілаланіну у промислових масштабах, доцільним є використання рекомбінантних штамів, зокрема штамів родів Bacillus Escherichia, що продукують фенілаланін у найвищій концентрації [2].

Враховуючи широкий спектр промислового використання фенілаланіну (використовується у сільському господарстві як кормові добавки; як компонент спортивного харчування; на виробництво дипептида аспартама – синтетичного цукрозамінника) доцільно його отримувати в великих кількостях, що здійснюється за рахунок використання біотехнологічних способів виробництва [1]. Оскільки потреби промислової галузі в фенілаланіні є досить великими постає запитання вітчизняного виробництва та відповідно використання найперспективніших продуцентів з метою отримання цільового продукту у найвищій концентрації.

Сфери застосування фенілаланіну

Кормові добавки. Для найвищого ефекту в рості та продуктивності тварин широко використовують кормові добавки. Особливо чутливим до нестачі незамінних амінокислот в раціоні є молодняк свиней. Тому раціони для них необхідно збагачувати повноцінним за амінокислотами кормами – горохом, соєвим і соняшниковим шротами, рибним, м'ясо-кістковим борошном, збираним молоком, сироваткою. При нестачі кормів, які містять в достатній кількості амінокислоти доцільно застосувати синтетичні амінокислоти, зокрема фенілаланін [3].

Компонент спортивного харчування. Фенілаланін приймає участь у рості м’язової тканини, бере участь у синтезі норепінефріну – речовини, яка передає сигнали від нервових клітин до головного мозку За даними соцдосліджень, проведеними Міністерством сім'ї, молоді та спорту, в Україні (станом на 25 червня 2013 р.) фізкультурою та спортом займаються близько 5 мільйонів людей, тобто трохи більше 10 % українців. На добу в раціоні спортсмена має бути приблизно 2-3 г білка на 1 кг власної ваги. Добова норма незамінних амінокислот, наприклад, для бодібілдера складає близько 3 г. Тому для збалансування харчування спортсменів рекомендується використовувати добавки, які містять повний спектр вітамінів та амінокислот та ідеально підходять для силової підготовки спортсмена та нарощування м’язової тканини [4].

Харчова промисловість. Значна частина фенілаланіну йде на виробництво дипептида аспартама – синтетичного цукрозамінника. Надмірне вживання аспартаму у складі напоїв (до 8 л/добу) може призвести до судом, втрати пам’яті, головного болю, дискомфорту у шлунку та подразнення шкіри. Допустима добова доза аспартаму обмежена – 40 мг/кг маси тіла. Враховуючи, що фенілаланін в харчовій промисловості використовують найчастіше, і споживають амінокислоти зазвичай з їжею, то потреби в виробленні фенілаланіу як добавки не має [5].

Медицина. Фенілаланін використовується лише при дієтотерапії, яка передбачає лікування фенілкетонурії (ФКУ). Дана хвороба пов’язана з порушенням метаболізму фенілаланіну і супроводжується накопиченням амінокислоти та її токсичних продуктів і призводить до ураження центральної нервової системи. Лікування ФКУ передбачає строге обмеження фенілаланіну в продуктах, з раціону абсолютно виключається вся білкова їжа тваринного походження. На першому етапі лікування малюки отримують їжу, в якій цілком відсутній фенілаланін, оскільки він може бути токсичним для організму. Найсуворіша дієта дотримується протягом п’яти років життя. У більш дорослому віці знижується сприйнятливість нервовою системою небезпечного впливу фенілаланіну та його продуктів розпаду, тому діти віком 16-18 років можуть переходити на звичайне харчування, проте бажано контролювати кількість білків тваринного походження і надалі. В Україні хворих на ФКУ близько 10 тисяч людей, враховуючи, що кількість амінокислоти для хворого є мінімальною, то додатково виробляти фенілаланін не потрібно [6].

Перспективні продуценти фенілаланіну

Продуцентами фенілаланіну можуть бути представники різних родів: Bacillus, Brevibacterium, Escherichia. Однак, дані продуценти не є високоефективними для отримання фенілаланіну. У промислових масштабах доцільним є використання рекомбінантних штамів-продуцентів [2].

Одним з таких штамів є представник роду Bacillus – штам B. subtilis ВКПМ В-3552. Запропонований штам характеризується досить не тривалим періодом ферментації – близько 46-72 год порівняно з прототипами продуцентів даного роду, на простих за складом поживних середовищах, які містять сахарозу, джерела азоту (солі амонію чи мочевину), мінеральні солі, а в якості джерела ростового субстрату – кукурудзяний екстракт. В результаті культивування штаму за оптимальних умов вдається отримати близько 13 г/л фенілаланіну [7].

Ше одним перспективним продуцентом роду Bacillus є штам B. subtilis ВКПМ В-4761 здатний продукувати близько 17 г/л амінокислоти. За рахунок росту посівного матеріалу на поживному середовищі, де в якості джерела вуглецю використовують сахарозу або технологічний цукор, в якості азоту – сечовину або амонійні солі та кукурудзяний екстракт в якості ростового субстрату вдається отримати більший вихід цільового продукті порівняно зі штамом В. subtilis ВКПМ В-3552 [8].

Для промислового використання широко застосовують рекомбінантні штами роду Escherichia. Одним із таких продуцентів амінокислоти є штам Е. coli АJ12739, який характеризується посиленою експресією гену pgl за рахунок чого підвищується здатність до продукування фенілаланіну. Максимальна концентрація амінокислоти становить 1,9 г/л за умови використання штаму в якості продуценту та росту на поживному середовищі з джерелом вуглецю – глюкозою та додатковими факторами росту – тіаміном та тирозином [9].

Нещодавно були проведені дослідження штаму Е. coli DV157, який має в своєму складі мутантний yddG ген. Штам має додаткову копію yddG гена, об’єднану в htrE гені. За результатами експерименту було виявлено, що концентрація фенілаланіну за 48 год культивування становить 0,36 г/л [10].

У результаті використання регуляторних мутантів та застосування методів генної інженерії було отримано штами E. coli, здатні синтезувати до 50 г/л фенілаланіну. До таких штамів-продуцентів належать E. соli MWPWJ 304 (KCCM 10013), що синтезує 50,8 г/л фенілаланіну та E. сoli MWPEC 13-60, здатний синтезувати 42,8 г/л. Поживні середовища даних штамів схожі за своїм складом, джерелом вуглецю та азоту, технологією виробництва. Відмінними є тривалість культивування, спосіб культивування та безпосередньо особливості процесу для штамів. Особливістю штамів є ріст на середовищах з початковою концентрацією глюкози – 60 г/л з подальшим дробним внесенням субстрату порціями до кінцевої концентрації [11, 12].

Одним із найперспективніших продуцентів є штам E. coli BR-42 (pAP-B03), що був запропонований 2011 року і характеризується стійкістю до бактеріофагу ВР-1. За використання даного штаму концентрація амінокислоти становить 57,6 г/л на середовищі, що додатково збагачене ароматичною амінокислотою – тирозином [13].

Отже, перспективним для промислового культивування є штам E. соli MWPWJ 304 (KCCM 10013), який за простих умов культивування та не дорогого середовища синтезує близько 50,8 г/л фенілаланіну. Незважаючи, на те, що даний штам функціонує з 1994 року він є найкращим для промислового виробництва [17]. Враховуючи, що штами-продуценти E. coli BR-42 (pAP-B03) та ще не досконало вивчений штам E.coli W14 30 представлені на промисловому виробництві лише з 2011 року – в перспективі цілком можуть замінити обраний штам.

Література:

1. Пирог Т.П., Ігнатова О.А. Загальна біотехнологія: Підруч. – К.: НУХТ, 2009. – 335 с.

2. Пенчук Ю.М., Васильківська М.К. Сучасний стан та перспективи біотехнологічних методів виробництва амінокислот. – УДК 661.185. – Ukr. food jour. — 2012. — № 2. — С. 51 – 54.

3. Бірта Г.О. Товарознавча характеристика продукції свинарства: Навчальний посібник присвячений вивченню товарознавчої характеристики продукції свинарства / Г.О. Бірта. – Київ, 2011. – 144 с.

4. Інвестиції у розвиток спорту – інвестиції у розвиток здоров’я дітей. – [Електронний ресурс] // Веб-сайт Рівненської державної обласної адміністрації. – 2013. – Режим доступу до статті: http://www.rv.gov.ua/sitenew/main/ua/publication/content/21493.htm/ .

5. Адамчук Т.В. Підсолоджувачі та принципи їх регламентування / Т.В. Адамчук // Проблеми харчування. – 2003. - № 1. – С. 23-25.

6. Исаева А.Д. Фенилкетонурия (ФКУ). Причины, симптомы, диагностика и лечение фенилкетонурии. Лечение фенилкетонурии: диета и питание [Електронный ресурс] / А.Д. Исаева // Медицынский сайт «Polishmed». – 2013. – Режим доступу до статті: http://www.polismed.com/articles-fenilketonurija-fku-prichiny-simptomy-diagnostika.html.

7. Патент № 1380212 А1 SU. Способ получения L-фенилаланина / Великжанина Г.А., Ямпольская Т.А., Жданова Н.И., Бачина Т.А., Васильева Н.А., Соколов А.К., Рошаль Е.Р., Шолин А.Ф., Тимохина Е.А. – Опубл. 07.12.91. – Бюл. № 45.

8. Патент SU № 1693056 А1. Штамм бактерий Вacillus subtilis – продуцент L-фенилаланина / Великжанина Г.А., Ямпольская Т.А., Жданова Н.И., Бачина Т.А., Васильева Н.А., Соколов А.К. – Опубл. 23.11.91. – Бюл. № 43.

9. Патент № 2229513 РФ. Способ получения L-аминокислот, штамм Escherichia coli – продуцент L-аминокислоты (варианты) / Лившиц В.А., Витушкина М.В., Машко С.В., Дорошенко В.Г. – Опубл. 27.01.2004.

10. Патент WO № 2013129432 А1. A mutant protein encoded by the yddG gene, and a method for producing aromatic L-aminoacids using a bacterium of the genus Escherichia / Airikh L.G., Doroshenko V.G., Tsyrenzhapova I.S. – Publ. 06.09.2013.

11. Patеnt EP № 0284185 B1. Method for production of L-phenylalanine by recombinant E.coli / L.S. Bae, W.C. Hee. – Publ. 20.04.94

12. Patеnt US № 5304475. Method for production of L-phenylalanine by recombinant E.coli / H.Y. Kim, D.J. Lee, C.H. Won, B.L. Lim, H.G. Choi. – Publ. 19.04.1994.

13. Zhou H, Liao X, Liu L, Wang T, Chen J, Du G. Enhanced L-phenylalanine production by recombinant Escherichia coli BR-42 (pAP-B03) resistant to bacteriophage BP-1 via a two-stage feeding approach // Indust. Microbiol. Biotechnol. – 2011. – 38. – 9. – P. 1219-1227.