Медицина.Клиническая медицина

Захарченко И.Ю.,Склярова И.В.,.,Сипко О.И.,Химичева-Барманова В.А., Федоряка А.В., Ситало С.Г.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МАЛЯРИИ

Эпидемическая ситуация по малярии в мире остается угрожающей из-за существования эндемичных территорий, резистентности возбудителей к лекарственным препаратам, а переносчиков – к инсектицидам. Ежегодно малярией болеют до 500 млн. человек, а количество летальных исходов от 1,5 до 2,7 млн. У человека могут паразитировать 4 вида плазмодиев: (P. vivax, P. malariae, P. falciparum, P. ovale), которые отличаются между собой ареалом распространения, физиологией, вызываемыми клиническими проявлениями и их тяжестью. Возможны три пути передачи малярии: через комара, от матери плоду или новорожденному (вертикальная передача), трансфузионно через кровь. Плазмодии имеют сложный цикл развития, который происходит со сменой хозяев: половой цикл в теле комаров рода Anopheles (спорогония), бесполое размножение в клетках печени (тканевая (экзоэритроцитарная) шизогония), бесполое размножение в эритроцитах (эритроцитарная шизогония), формирование в эритроцитах половых форм (мужских и женских гаметоцитов). Период от заражения до появления паразитов в крови считается паразитологической инкубацией, до начала клинических проявлений – клинической инкубацией. Для малярии vivax и ovale возможно существование «дремлющих» форм. В большинстве случаев в крови больного можно выявить 3 – 4 и более взрослых форм паразитов. Исключением является лишь P. falciparum, когда в периферической крови можно выявить только кольца (дальнейшее развитие происходит в капиллярах внутренних органов). Также, в организме больного тропической малярией часто формируются несколько субпопуляций паразита, которые развиваются несинхронно, поэтому сроки окончания очередного эритроцитарного цикла шизогонии происходят в разные дни и часы, что определяет более частое возникновение лихорадочных приступов при тропической малярии. В эндемичных странах, где обнаруживается несколько видов возбудителей малярии, нередко регистрируется микст – инфекция, а в крови больного обнаруживаются разные виды паразитарных форм малярии .Окончательный клинический диагноз ставится только на основании нахождения малярийный плазмодиев в крови с их видовой идентификацией .Ведущим методом является микроскопическое исследование окрашенных препаратов крови – тонкого и толстого («толстой капли») мазков. Он считается классическим стандартом и дает возможность установить наличие плазмодиев в образце крови больного, идентифицировать их видовую принадлежность, определить уровень паразитемии. При этом в тонком мазке изучают морфологию паразита и изменения в инвазированных эритроцитах. В толстой капле определяют интенсивность паразитемии. Минимальное число паразитов, способных вызвать клинические проявления заболевания, носит название пирогенного порога. Минимальное число паразитов, которое может быть выявлено при микроскопии толстой капли, называется порогом обнаружения. Паразиты обнаруживаются в крови, как на высоте приступов, так и в промежутках между ними.В тонком мазке эритроциты имеют розовую окраску с фиолетовым оттенком, ядра лейкоцитов фиолетовые, хорошо структурированные (в гранулоцитах определяется зернистость), тромбоциты темно-розового или рубинового цвета. В толстой капле происходит гемолиз крови, дегемоглобинизация эритроцитов, изменяется вид форменных элементов крови: зрелые эритроциты отсутствуют, незрелые (ретикулоциты) частично сохраняются в виде синеватых сеточек; форменные элементы и паразиты кажутся меньшими по размерам, чем в тонком мазке; лейкоциты часто теряют цитоплазму, ядра сегментоядерных гранулоцитов иногда разрываются и их фрагменты лежат отдельно; тромбоциты имеют тенденцию к скоплению и могут напоминать морулы, от которых отличаются разнообразием размеров и отсутствием ядер.

Отдельные виды плазмодиев микроскопически отличаются, но на всех стадиях развития идентичные структуры паразита красятся всегда одинаково. Ядра (хроматин) плазмодиев обычно имеют круглую форму и окрашиваются в пурпурно-красный цвет; цитоплазма может иметь разную форму – от кольцевидной до абсолютно неправильной - и всегда окрашивается в оттенки синего цвета. При исследовании препаратов крови обращают внимание на такие признаки: размер пораженных эритроцитов по сравнению с непораженными, форма эритроцитов, наличие азурофильных (окрашенных азуром в красно-фиолетовый цвет) элементов и их вид, разнообразие бесполых форм в поле зрения или в препарате, наличие и морфология гаметоцитов, число мерозоитов в зрелом шизонте, форма, размер и расположение зерен малярийного пигмента Малярийные плазмодии в «толстой капле» выглядят несколько иначе, чем в тонком мазке, что связано с техникой приготовления препаратов. В толстой капле эритроциты гемолизируются, лейкоциты несколько деформируются. Плазмодии частично разрываются, частично сморщиваются. Основным методом микроскопической диагностики малярии является исследование толстой капли. Диагностику малярии по тонкому мазку ВОЗ (2000г.) рекомендует проводить только при невозможности исследования толстой капли (она слишком мала, произошла ее спонтанная фиксация, мазок испортился и т.д.) и для подтверждения вида плазмодия .Отрицательные результаты просмотра тонкого мазка не являются достоверными, хотя просмотр длится в 10 раз дольше, чем толстой капли. В последней содержится в 20 – 40 раз больший объем крови, чем в тонком мазке, и есть возможность увидеть большее число особей паразита. При положительном результате исследования тонкого мазка толстую каплю исследуют для выявления микст-инвазии и определения уровня паразитемии. Рутинное исследование толстой капли крови обычно основано на изучении 100 "хороших" полей зрения. Таким образом, заключение об отсутствии в препарате возбудителей малярии можно сделать только после отрицательных результатов исследования 100, а лучше 200 полей зрения. Если в одном из полей зрения обнаружены паразиты, необходимо дополнительно исследовать еще 100 полей зрения, прежде чем будет сделано окончательное заключение о видовой принадлежности выявленных возбудителей. Просмотр двух толстых капель считается более эффективным, чем одной за то же самое время. При просмотре 100 полей зрения толстой капли исследуется примерно 0,2 – 0,25 мкл крови. Чувствительность метода – выявление 10 – 20 особей паразита в 1 мкл крови, что соответствует паразитемии 0,004%. Порог выявления плазмодиев – 5 – 8 паразитов в 1 мкл крови, то есть 1 паразит в 100 полях зрения. Подтверждением клинического диагноза малярии является выявление в препарате любых стадий паразита, которые развиваются в эритроцитах: бесполых форм – трофозоитов и шизонтов, а половых - мужских и женских гаметоцитов. Внеэритроцитарные стадии – мерозоиты – находятся в плазме крови очень короткое время и выявляются в ней редко.Достоинствами микроскопического метода диагностики малярии является его доступность, низкая цена (одно исследование стоит $ 0,1 – 0,12), скорость, надежность и точность в постановке диагноза. К недостаткам можно отнести то, что методика требует высокой квалификации микроскописта в идентификации видов малярийных плазмодиев.

Альтернативными методиками исследования крови на малярию являются: экспресс – методы диагностики малярии, флюоресцентная микроскопия центрифугата крови, иммунологические методы диагностики, молекулярно-биологические (молекулярно-генетические) методы, амплификация генов малярийных плазмодиев на основе полимеразной цепной реакции – ПЦР.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бинка Ф. Цели и задачи проекта кабинета ВОЗ «Обращение вспять малярии» // Мед. паразитол. – 2000. - №2. – С. 8 – 11.

2. Генис Д. Е. Медицинская паразитология. – 3 изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 1985. – С. 44 – 59

3. Глобальная стратегия по борьбе с малярией. – ВОЗ. – Женева, 1994. – 36с.

4. Микроскопическая диагностика малярии: ВОЗ, Европейское региональное бюро. – Копенгаген, 2000. – 88с.