Биологические науки/6. Микробиология

Гудзенко Т.В., Волювач О.В., Бухтіяров А.Є., Лісютин Г.В.,

Бєляєва Т.О., Пузирьова І.В., Конуп І.П., Денісов Г.Г., Дімова М.І.,

Горшкова О.Г., Паталай В.В., Котенко О.В., Остапчук Т.О.,

Стьопина Т.О., Писарська М.М.

Одеський національний університет імені І.І. Мечникова, Одеса

Біодеструкція нафтових вуглеводнів грунтовими мікроорганізмами роду Bacillus, виділеними із ділянки нафтозабрудненого грунту о. Зміїний

Для захисту навколишнього середовища від високотоксичних нафтових забруднень найбільш затребуваними останнім часом є екологічно чисті біотехнологічні методи, засновані на використанні мікроорганізмів-деструкторів нафтових вуглеводнів [1-3].

Мета роботи – дослідження здатності грунтових мікроорганізмів до деструкції вуглеводнів нафти.

Об’єктами дослідження слугували штами мікроорганізмів роду Bacillus: Bacillus sp. 2₂, Bacillus sp. 2₄, Bacillus sp. 2_6, виділені з нафтозабрудненої ділянки засоленого грунту о. Зміїний. В експериментах використовували сиру нафту темно-коричневого кольору з густиною 0,84 г/см³. Дослідження проводили при температурі 28 ^оС. Культивування бактерій здійснювали на поживному середовищі МКД, що містило нафту у концентрації 10,0 мг/мл.

Вперше досліджено процес фізико-хімічної утилізації нафтових вуглеводнів (залишковий вміст нафтових вуглеводнів у контролі на середовищі МКД з нафтою за відсутністю мікроорганізмів) і біодеструкції (залишковий вміст нафтових вуглеводнів окремо в об’ємі досліджуваних проб (рис. 1.А.), в плівках (таблиця) і адсорбованих на стінках пробірок (рис. 1.Б)). Математичну обробку представлених на рис. 1. аналітичних сигналів, зареєстрованих аналізатором “ИКС-29“ в інформативному діапазоні хвильових чисел здійснювали за формулою (1): ΔD = - ln (T₁/T₂) (1), де ΔD – різниця оптичних густин при хвильових числах, що відповідають максимуму і мінімуму смуги поглинання; T₁ – значення пропускання (%) в максимумі смуги поглинання при (2926±15) см^-1; T₂ – значення пропускання (%) в мінімумі смуги поглинання при (2700±15) см^-1.

Рис. 1. Аналітичні сигнали, зареєстровані аналізатором “ИКС-29“ в діапазоні хвильових чисел 2700-3200 см^-1 при визначенні вуглеводнів нафти в об’ємі досліджуваних розчинів (А) і адсорбованих на стінках пробірок (Б) в процесі їх біодеструкції штамами бактерій роду Bacillus. Позначення: 1 – контроль; 2 – штам Bacillus sp. 2₂; 3 – штам Bacillus sp. 2₄; 4 – штам Bacillus sp. 2_6.

За попередньо побудованому градуйованому графіку ΔD=f(m_н), представленому на рис. 2, визначали практичний вміст (m_нв, мг; С_нв, мг/л) нафтових вуглеводнів у об’ємі досліджуваних проб (С_нв, мг/л) і адсорбованих на стінках пробірок у контрольній пробі і в процесі біодеструкції (m_нв, мг), враховуючи подвійне розбавлення елюату.

З метою відділення нафтових вуглеводнів від інших супутніх органічних полярних речовин чотирихлористий екстракт пропускали через хроматографічну колонку, заповнену оксидом алюмінію II ступеня активності по Брокману.

Знайдені по градуйованому графіку виміряні концентрації (C_(вимір), мг/л) перераховували на практичні концентрації, користуючись формулою (2): С=[C_(вимір)·V₁·n]/V₂ (2), де V₁ – об’єм чотирихлористого вуглецю, що був взятий для екстракції (V₁ = 25 мл); V₂ – об’єм проби: поживне середовище МКД з нафтою у відсутності мікроорганізмів (контроль), поживне середовище МКД з мікроорганізмами і нафтою (V₂ = 10 мл); n – коефіцієнт розбавлення елюату. Практичну концентрацію нафтових вуглеводнів, що знаходились в об’ємі досліджуваних проб у істинно-розчинному та емульгованому стані, перераховували на m_нв, мг.

Рис. 2. Градуйований графік визначення нафтових вуглеводнів

В результаті досліджень встановлено (таблиця), що у в контрольній пробі за рахунок фізико-хімічних процесів вміст вуглеводнів нафти за три місяці при температурі 28⁰С зменшився з 10,0±0,05 до 6,68±0,80 мг (на 33,2%).

В експериментальних пробах, що містили суспензії бактерій Bacillus sp. 2_2, Bacillus sp. 2₄, Bacillus sp. 2₆, за рахунок біодеструкції сумарний вміст вуглеводнів нафти (що знаходились в бактеріальних суспензіях в істинно-розчинному і емульгованому станах, у вигляді плівки і були адсорбовані в процесі біодеструкції на стінках пробірок) зменшився, відповідно, до 3,46 ±0,50 мг (на 65,4%), 1,72 ±0,10 мг (на 82,2%) і 4,66 ±0,30 мг (на 53,4%)_.

Найбільш активно проходила біодеструкція істинно-розчинних і емульгованих вуглеводнів нафти у об’ємі досліджуваних проб – на 56,2% - штам Bacillus sp. 2₂, 87,5 % штам Bacillus sp. 24.

Таблиця

Залишковий вміст нафтових вуглеводнів (НВ) в процесі біодеструкції

Штам	Т1,%	Т2,%	Т1/Т2	ΔD= - ln(Т1/Т2)	mнв, мг
	(із рис. 1.А, 1.Б.)
Залишковий вміст істинно-розчинних і емульгованих НВ
контроль	87	97	0,897	0,16	1,28±0,22
22	93	98	0,950	0,07	0,56±0,05
24	99	100	0,990	0,02	0,16±0,02
26	97	98	0,989	0,02	0,16±0,03
Вміст адсорбованих на стінках пробірок нафтових НВ
контроль	18	98	0,184	1,690	5,32±0,70
22	34	87	0,391	0,939	2,90±0,25
24	57	93	0,613	0,489	1,56±0,07
26	76	95	0,800	0,223	0,66±0,04
Вміст НВ у поверхневій та придонній плівках
контроль	84	86	0,977	0,023	0,08±0,01
26	27	86	0,314	1,16	3,84±0,65

За своєю нафтодеструктивною здатністю з поправкою на контроль штами бактерій роду Bacillus розташовуються в такій послідовності: 2₄ (74,0%) > 2₂ (47,6%) > 2₆ (30,2%). Отже, із досліджуваних штамів бактерій роду Bacillus найефективнішим є штам Bacillus sp. 2₄.

Література:

1. Королев В.А., Ситар К.А. Рекультивация нефтезагрязненных земель // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. – 2004. – № 2. – С. 69–76.

2. Патент на винахід № 95859 “Біопрепарат для сорбції і деструкції вуглеводнів і спосіб очищення води та/або грунту від забруднень нафтою та нафтопродуктами”. Дата публікації: 12.09.2011, Бюл. № 17, 2011р.

3. Leahy J.G., Colwell R.R. Microbial dеgradation of hydrocarbons in the environment // Microbiol. Rev. – 1990. – Vol. 54. – P. 305–315.