Д. с-х. н. Котляров В.В., Сединина Н.В., к. б. н. Котляров Д. В.,

к. б. н. Донченко Д. Ю.

Кубанский государственный аграрный университет, Россия

АМИНОКИСЛОТА - АКТИВАТОР РОСТА БАКТЕРИЙ Pseudomonas fluorescens штамм АР-33, ПРИМЕНЯЕМЫХ В БАКОВОЙ СМЕСИ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

Организация сельскохозяйственного производства, на базе малотоннажных предприятий, предполагающая создание собственного цеха для получения микробиологических препаратов в требуемых объемах, предусматривает использование в питательной среде веществ или компонентов, стимулирующих рост основной микрофлоры, составляющей препарат, и, веществ, подавляющих рост посторонней микрофлоры. Кроме того, при организации сельскохозяйственного производства необходимо учитывать период сохранения микроорганизмами их жизнеспособности (при отсутствии возможности пополнения питательной среды новыми компонентами, т. к. процесс носит периодический характер), и использовать вещества, вводимые в баковую смесь, увеличивающие жизнеспособность микроорганизмов и стимулирующие процессы увеличения их численности. Известно, что бактерии рода Pseudomonas, входящие в состав жидких препаратов, применяемых для протравливания семенного материала и вегетационных обработок растений, характеризуются высоким титром, но коротким сроком годности - 30 суток. При этом срок фунгицидного действия ограничивается 5-7 сутками [5]. Очевидно, это связано с тем, что бактерия, являясь грамотрицательной не образующей спор палочкой, не получая новых питательных веществ в процессе хранения, переходит в фазу снижения роста и уменьшает свою активность. Однако существующие литературные данные подтверждают, что некоторые штаммы Pseudomonas сохраняют жизнедеятельность в течение 6 месяцев [4]. При этом уменьшается титр препарата, но фунгицидная активность снижается незначительно [4, 5]. На базе ФГБОУ ВПО «Кубанский госагроуниверситет» ООО МИП «Кубанские агротехнологии» разработана технологическая схема получения микробиологического препарата, получаемого из концентрата бактерий Pseudomonas на питательной среде из отрубей в течение 5-7 суток [3]. Для культивирования большинства видов Pseudomonas в промышленных условиях приемлемой является среда по составу аналогичная среде Кинга, включающая сульфаты калия, магния, глицерин. Таким образом, в качестве объекта исследовния нами были выбраны бактерии P. fluorescens штамм АР-33 (рис. 1). Известно, что бактерии этого вида способны расти в интервале температур от +4^оС до +41^оС. Не обладают редукцией нитратов, способны к окислению глюкозы, каталазаположительные грамотрицательные палочки [1]. Препараты на основе этих бактерии применяются в биологической защите растений от болезней, вызываемых грибами и бактериями (бурая ржавчина, темно-бурая и сетчатая пятнистости, септориоз, ризоктониоз, корневые гнили и т.д.), способствуют укреплению иммунитета растений. В задачи исследования входило: определение ростостимулирующего или подавляющего действия на бактерии P. fluorescens штамм АР-33 аминокислоты, вводимой в питательную среду и улучшение состава существующей рецептуры питательной среды. А так же определение влияния конечной величины рН питательной среды на P. fluorescens штамм АР-33 в связи с изменением рН среды после внесения аминокислоты.

Рисунок 1 – Бактерии P. fluorescens штамм АР-33 (фото Седининой Н.В.)

Материал и методика исследований:

Культивирование осуществляли на питательной среде, применяемой в ООО МИП «Кубанские агротехнологии», основу которой составляли отруби (рис. 2). Инокуляцию питательной среды в лабораторных условиях проводили взвесью 1 мл чистой культуры P. fluorescens штамм АР-33 титр 1х10⁹ КОЕ/мл, вносимой в 100 мл среды. Таким образом, уменьшая начальную микробную нагрузку до 1х10⁷ КОЕ/мл питательной среды.

Рисунок 2 – Культивирование Pseudomonas в лабораторных условиях на среде из отрубей (фото Седининой Н.В.)

Контрольный образец (№1) представлял собой культуральную жидкость, содержащую микроорганизмы P. fluorescens штамм АР-33 в вегетативной форме, а так же продукты их метаболизма. В качестве образцов, применяемых для сравнительной оценки, использовали образцы, полученные путем культивирования микроорганизмов на питательной среде с добавлением в нее 0,01% одной из гетероциклических аминокислот [2] - образец № 2. Определение количества жизнеспособных клеток P. fluorescens штамм АР-33 осуществляли путем посева разведений, полученных культуральных жидкостей на ГРМ-агар (гидролизат рыбной муки агар) - питательную среду для бактерий и подсчетом выросших на ней колоний (рис. 3 и 4). В таблице 1 представлены результаты 4, 7 и 10-исуточного культивирования бактерий. Культивирование бактерий не ограничивали 10-суточным сроком их роста, но методики культивирования бактерий в стандартной микробиологии свидетельствуют о том, что бактериальные клетки развиваются в течение 3-5 суток, поэтому в данной статье ограничились представлением результатов 10-исуточного роста. При длительном культивировании в связи с истощением питательной среды или продолжительном хранении, а также при недостаточной аэрации в лабораторных условиях могут изменяться морфолологические характеристики этих бактерий. Температура культивирования бактерий составляла 30±2 ^оС.

Результаты исследований:

Рисунок 3 – P. fluorescens штамм АР-33 - 4, 7 и 10-исуточный контрольный образец, культивируемый на среде из отрубей; рост на ГРМ-агаре (фото Седининой Н. В.)

Рисунок 4 – P. fluorescens штамм АР-33 - 4, 7 и 10-исуточный образец, культивируемый на среде с добавлением 0,01% аминокислоты; рост на ГРМ-агаре

(фото Седининой Н. В.)

Таблица 1

рН питательной среды и количество P. fluorescens штамм АР-33 в культуральных жидкостях с использованием аминокислоты и без нее

Вариант	Количество КОЕ/мл			рН среды
	4 суток роста	7 суток роста	10 суток роста	начальный	конечный
№1 - Контроль	9,6х10^9	6,0х10^9	2,2 х10^8	7,0	5,0
№2 - Культуральная жидкость с добавлением 0,01% аминокислоты	2,2х10^10	3,5х10^11	4,0х10^8	6,98	4,8

Как показывают результаты, проведенного микробиологического исследования, добавление аминокислоты в дозировке 0,01% к объему питательной среды, способствует увеличению числа колоний бактерий P. fluorescens. Однако культивирование бактерий необходимо ограничивать 7-суточным ростом. Мы это связываем с тем, что сама по себе аминокислота рН питательной среды в значительной степени не снижает. Но увеличение числа бактерий, приводит к увеличению скорости разложения других компонентов питательной среды, что может стать причиной накопления метаболических веществ и продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в питательной среде, в т. ч. и кислот, которые сдвигают рН в кислую область. Увеличение на 7-ые сутки культивирования бактерий в среде добавлением аминокислоты числа колониеобразующих единиц микроорганизмов с 6,0х10⁹ до 3,5х10¹¹ позволяет снизить расход препарата, получаемого на основе P. fluorescens, для протравливания семян или обработок растений в период вегетации. Представленный материал использован для оптимизации технологического процесса получения препарата на базе ООО МИП «Кубанские агротехнолгии».

Литература:

1.Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В. В., Делекторская Н. Н., Золотницкая Р. П., и др. – М.: Медицина, 1987, - 368 с.

2.Тюкавкина Н. А., Бауков Ю. И. Биоорганическая химия: Учебник. – М.: Медицина, 1991. – 528с.

3.Котляров В.В., Сединина Н. В. Инновационная концепция микробиологической защиты растений // Материалы 3-го Всероссийского съезда по защите растений (16-20 декабря 2013г., СПб).

4.Ю.А. Саламатова Ю. А, Минаева О. М.Эффективность хранения ряда бактериальных препаратов в жидкой форме // Вестник Томского государственного университета. 2010. – вып. 1(9). – С. 20-28.

5. http://www.agrariy-39.ru/ В.А. Есельсон Планриз перспективный препарат для защиты растений